作者:孙庆云，曹金凤，王 跃，周 亮等，河北医科大学第二医院

随着玻璃化冷冻技术的成熟及广泛应用于人类 胚胎的冷冻保存，冻融胚胎移植( FET) 一方面避免了 胚胎的浪费，增加了患者的累积妊娠率，另一方面减 轻患者的经济负担，降低了多胎率[1]。对于解冻后胚 胎体外培养多长时间后移植能获得更好的妊娠结局 国内外学者观点不一。本研究主要探讨早卵裂期胚 胎解冻后短时培养后解冻日移植和过夜培养后移植 对妊娠结局的影响，旨在更好地指导临床工作。

1 资料与方法

1. 1 一般资料及分组 回顾性分析 2015 年 1 月至 2016 年 12 月在河北医科大学第二医院行 FET 的 4294 周期( 3443 例) 患者的临床资料，所有胚胎均为 玻璃化冷冻，共解冻胚胎 10007 枚，复苏存活胚胎 9948 枚，复苏率为 99. 41%，全活胚胎 9863 枚，全活率为 98. 56%。纳入标准:FET 患者的年龄≤38 岁;移植胚胎 数均为2 枚;解冻胚胎均为早卵裂期胚胎;移植日患者 子宫内膜在 8~15 mm;无子宫肌瘤及输卵管积水。按 胚胎解冻后培养时间的不同将患者分为两组:过夜培养 组为解冻后培养26~27 小时后移植，共693 周期;短时 培养组为解冻后培养4~6 小时解冻日移植，共3601 周 期，比较两组的妊娠结局，并进一步比较首次 FET 的患 者和 FET≥3 次患者中过夜培养和短时培养两组的妊 娠结局。两组不同分类的患者一般情况比较，差异无统 计学意义( P>0. 05) 。见表 1。所有患者及家属均签署 知情同意书，并经医院伦理委员会通过。

表 1 两组不同分类的患者一般情况比较

1. 2 内膜准备方案 根据患者的情况，以患者是否 规律性排卵选择自然周期或人工内膜周期。月经周 期规律，排卵正常可采用自然周期，在月经第 10 天左 右开始监测卵泡情况，同时观察子宫内膜情况，如果 内膜薄可予戊酸雌二醇2~4 mg 口服，每天 2 次，卵泡 消失日予黄体酮 20 mg 肌内注射每天 1 次，第 3 天解 冻胚胎，短时培养解冻日移植或过夜培养后移植。移 植后黄体酮 20 mg 肌内注射每天 1 次行黄体支持， B 超检查见心管博动2 周后逐渐减量至停止;人工内膜 周期是从月经第3~5 天给戊酸雌二醇( 补佳乐，拜耳 公司，德国) 2~4 mg，每天 2 次，还可根据患者的内膜 情况增加用药剂量，待内膜≥8 mm 以上且血雌二醇 ( E2) ≥732 pmol/L 时每日分别给予黄体酮 40 mg、 60 mg、 60 mg、60 mg 肌内注射 4 天，于肌内注射黄体 酮第 4 天解冻胚胎，短时培养解冻日移植或过夜培养 后移植，移植后黄体酮 60 mg 肌内注射每天 1 次或黄 体酮阴道缓释凝胶90 mg 阴道给药每天1 次行黄体支 持， B 超检查见心管博动调后逐渐减量至停止。

1. 3 胚胎冻融和复活标准所有患者的胚胎均为玻 璃化冷冻，且均采用快速解冻法解冻，采用广州协和 医药公司的玻化冷冻试剂盒( JY) ，载体采用自制封闭 式麦管即 0. 25 ml 冷冻麦管剪一斜面，外套 0. 5 ml 冷 冻麦管。冷冻过程:试剂从冰箱取出平衡 20 ~ 30 分 钟，将 2~3 个胚胎放入含 7. 5%乙二醇( EG) 和 7. 5% 二甲基亚砜( DMSO) V1 液中，时间控制在 5~6 分钟， 移入 V2 液( 15%EG 和 15%DMSO 0. 5 mol/L 蔗糖) 中，冲洗数遍后迅速用吸管将胚胎一次性放入冷冻载 体上，封管，置入液氮，整个过程不超过 70 秒，将胚胎 于液氮中保存。复苏过程:将含胚胎载体从液氮取 出，迅速置入室温平衡好的复苏液 1( 1. 0 mol/L 蔗 糖) 1 分钟，转移至复苏液 2( 0. 5 mol/L 蔗糖) 中 2 分 钟，复苏液3( 0. 25 mol/L 蔗糖) 中3 分钟，平衡液10% 白蛋白( HSA) 的 3( N-吗啉基) 丙磺酸( MOPS) 中 5 分钟，并逐渐升温至 37℃，最后转移至已平衡过夜的 5%HSA 的囊胚培养液( G2，Vitrolife 公司，瑞典) 中，置 于 37℃ 6%CO2 培养箱内培养。 1. 4 胚胎评分标准和冷冻标准早卵裂期胚胎评分 按英国 Bourn Hall Clinic 标准[2]: Ⅰ级: 胚胎卵裂球均 匀规则、胞浆均质透明，透明带完整; 胞质均匀清晰; 胚胎无或者仅有极少( <10%) 的碎片。Ⅱ级: 胚胎卵裂球不甚均匀规则、胞浆遮光性有轻微改变;卵裂球 的碎片<30%，透明带完整。Ⅲ级: 胚胎卵裂球碎片< 50%，其余卵裂球的情况应该类似于Ⅱ级胚胎，透明 带完整。Ⅳ级:卵裂球碎片>50%，其余卵裂球应具活 细胞的特征。胞浆折光度有较大的改变，胞浆变黑、 颗粒不均匀。Ⅴ级:受精延迟的胚胎，或受精失败后 在第 2 天进行重新授精发育而来的胚胎。Ⅵ级: 胚胎 无活性，卵裂球退化、皱缩、发黑。冷冻标准: 按以上 标准达到Ⅰ级和Ⅱ级的胚胎征得患者同意后行胚胎 玻璃化冷冻保存。

1. 5 妊娠确定 所有患者均于完成胚胎移植后第 14 天对尿或血清 β-HCG 水平进行检测，若满足尿 HCG 阳性或血 β-HCG≥10 U/L 定为生化妊娠，则于移植 后28~30 天行阴道 B 超检查，发现妊娠囊或胎心搏动 可确诊为临床妊娠。

1. 6 统计学分析 采用 SPSS 20. 0 软件进行统计分 析，计数资料应用 χ2 检验，计量资料应用 t 检验; P< 0. 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 过夜培养和短时培养两组 FET 患者妊娠结局的 比较 过夜培养组的 FET 患者的临床妊娠率、异位妊 娠率低于短时培养组，差异有统计学意义( P<0. 05) ， 而两组 FET 患者种植率、多胎率、流产率比较，差异无 统计学意义( P>0. 05) 。见表 2。

表 2 两组 FET 患者妊娠结局的比较

2. 2 两组中全胚冷冻后首次 FET 患者妊娠结局的比 较 过夜培养组 123 例，共 123 周期，短时培养组 1538 例，共 1538 周期。过夜培养组 FET 患者多胎率 高于短时培养组，差异有统计学意义( P<0. 05) ，而两 组患者临床妊娠率、种植率、流产率、异位妊娠率比 较，差异无统计学意义( P>0. 05) 。见表 3。 2. 3 两组中 FET≥3 次患者的妊娠结局比较过夜 培养组 100 例，共 104 周期，短时培养组 196 例，共 214 周期。两组 FET 患者临床妊娠率、种植率、多胎率、流产率、异位妊娠率比较，差异无统计学意义( P> 0. 05) 。见表 4。

表 3 两组中全胚冷冻首次 FET 患者妊娠结局的比较

表 4 两组中 FET≥3 次患者的妊娠结局的比较

3 讨 论

随着胚胎冷冻技术的发展，玻璃化冷冻技术不断 改进，冻融胚胎的复苏率有了很大提高，我院达到了 99. 41%以上，这是 FET 患者成功的前提。影响 FET 临床妊娠率的因素较多，如患者年龄、子宫内膜厚度、 移植胚胎数和胚胎质量等[3， 4]，本研究在患者年龄、不 孕年限、内膜厚度、胚胎质量无差异的情况下，移植胚 胎数均为 2 枚，进一步研究过夜培养对 FET 患者妊娠 结局的影响。

3. 1 过夜培养对 FET 患者妊娠结局的影响关于卵 裂期胚胎解冻后过夜培养对 FET 妊娠结局的影响国 内外专家报道不一。有报道[5~7]，延长解冻后胚胎的 体外培养时间有助于提高 FET 患者的妊娠率，但在该 研究中，解冻患者大部分胚胎数要多于移植胚胎数， 通过过夜培养后，选择的是较好的具有发育潜能的优 质胚胎移植。尤其是慢速冷冻是一个冷冻管装载多 个胚胎，而最终只移植 2~3 枚胚胎，对胚胎有一个进 一步选择的过程，另外患者移植胚胎数并不均等，且 培养后观察胚胎进一步分裂情况，分裂情况好的移植 后妊娠率较高[8]。另有学者报道[9]解冻当天移植会 得到更高的种植率和活产率，还有报道[10]过夜培养不但没有增加妊娠率反而使早期流产率有所增加。本 研究回顾性分析了 4294 周期的 FET 患者，共解冻胚 胎 10007 枚，例数较多，大多数患者解冻胚胎数为 2 枚，且所有患者均为移植 2 枚存活胚胎。因年龄≥38 岁时患者妊娠率下降明显[11]，为避免年龄对妊娠率的 影响，本研究将入选对象年龄的界限选择为≤38 岁， 结果显示，两组患者解冻胚胎过夜培养和短时培养的 妊娠率分别为 51. 23%和 55. 60%，差异有统计学意义 ( P<0. 05) ，而两组的种植率、流产率、多胎率差异均 无统计学意义( P>0. 05) 。本研究的结果与一些报道 结论[12， 13]一致，提示在没有过多胚胎选择的情况下过 夜培养并不能增加 FET 患者妊娠率，短时培养胚胎着 床率较高，可能体内环境更适合胚胎的发育。尽管体 外培养模拟输卵管和子宫的环境，没有证据表明体外 发育受阻体内发育也会受阻，毕竟体内才是胚胎发育 最适宜的环境，这就进一步提示在没有多余胚胎可以 选择的情况下，应尽量选择解冻日即当天移植，以提 高患者的妊娠率。本研究中过夜培养和短时培养两 组患者异位妊娠率分别为 1. 13%和 3. 05%，差异有统 计学意义( P<0. 05) 。Du 等[14]认为，D5、D6 胚胎移植 较 D3 胚胎移植可以显著降低其异位妊娠率。我们的 研究结果显示早卵裂期胚胎解冻后过夜培养组较短时 培养组的异位妊娠率是显著降低的，可能过夜培养后融 合胚或者早期囊胚移植更接近人体自然生理情况，故有 异位妊娠史的患者可以考虑过夜培养或者囊胚培养并 告知患者继续培养可能有无胚胎移植的风险。

3. 2 过夜培养对首次 FET 患者妊娠结局的影响在 这组患者中，胚胎质量好，新鲜周期未移植行全部胚 胎冷冻，FET 首次移植，除外了多次移植不成功的其 他因素，FET 患者妊娠率、种植率、流产率以及异位妊 娠率差异均无统计学意义( P>0. 05) 。我们的研究中 多胎率在两组患者中过夜培养组和短时培养组分别 为 57. 35%和 43. 41%，差异有统计学意义( P<0. 05) 。 两组的多胎率均较高，过夜培养组更高，由于过夜培 养组例数少可能存在抽样误差，需要以后加大样本量 进一步研究。但提示我们在首次 FET 患者中多胎率 较高，由于这组患者的胚胎质量好，种植率较高，在以 后的工作中可以行单胚胎移植，尤其在子宫畸形、瘢 痕子宫、宫颈机能不全等患者行单胚胎移植或囊胚培 养行单囊胚移植，以避免多胎妊娠。

3. 3 过夜培养对 FET≥3 次的患者即多次治疗失败 患者妊娠结局的影响 对于反复移植种植失败的患 者，在改善患者自身不良因素外，探讨过夜培养是否 可以增加患者妊娠率。本研究对这组患者进行分析， 过夜培养和短时培养组临床妊娠率、种植率、流产率、 多胎率及异位妊娠率差异均无统计学意义( P >0. 05) ，但过夜培养组没有异位妊娠发生。故本研究 提示在移植胚胎数相同的情况下，过夜培养并不能增 加多次不成功的 FET 患者妊娠率和种植率，可能患者 不孕原因更复杂，单独增加解冻后体外培养时间并不 能改善其妊娠结局。 总之，过夜培养不增加 FET 患者临床妊娠率，尤 其在解冻胚胎数和移植胚胎数相同的情况下，早卵裂 期胚胎解冻日移植患者临床妊娠结局好;在全胚冷冻 行首次 FET 患者中多胎率高，可以行单胚胎移植或囊 胚培养后单囊胚移植，以避免多胎发生; 过夜培养不 能改善多次 FET 失败患者的妊娠结局;有异位妊娠史 的 FET 患者可以考虑过夜培养或囊胚培养后移植。

参考文献略。

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