为活细胞拍微影像

中研院应用科学研究中心的陈壁彰助研究员，与团队利用“空间光调变器”开发了“晶格层光显微镜”，具有高解析度、长时间观测、低光毒性的特性，改革了活体荧光显微术，使研究者能亲眼目睹例如细胞分裂等活体生命现象。

陈壁彰团队成员，与晶格层光显微镜。摄影／廖英凯

那些年，科学家如何“小”看世界

十七世纪起，Robert Hooke 与 Antoni van Leeuwenhoek 提出了显微镜的技术发展与改进，成为了微观尺度生物学的关键基础。随着显微镜的改良与倍率的提升，我们也越来越了解微观世界的样貌。一沙一世界的美丽境界，就随着一片片精心磨制的玻璃镜片，向科学家敞开了伟大的航道。

然而，到了十九世纪后期，科学家开始察觉到：显微镜似乎无法随着技术的进展，而使倍率不断地放大。

图／pixabay

Ernst Abbe 发现，这是由于光的波动性造成的干涉与绕射，导致显微镜所能得到的最小解析度，仅能是二分之一个用来观测的光的波长。例如，如果利用波长是 500 奈米的黄光来观测，所能得到的解析度就仅能有 250 奈米，虽还能看到细胞与细菌，但却无法看清楚细胞内各胞器的样貌。这一个波长的限制，也就是所谓的“绕射极限”。

为了突破绕射极限的阻碍，各种截然不同的思维与原理，催生了不依靠“可见光”来观测微观世界的显微术，包含：利用观测“电子”来显示物体内结构、或表面样貌的电子显微镜；利用原子间“凡得瓦力”的作用，来呈现物质表面样貌的原子力探针显微镜；或利用近场光学的方式，将光源与样品接近到只有数十个奈米，使距离拉远时，光学的干涉与绕射现象无法显现出来。

但多数相关观测技术，都需在相当限制的条件，例如真空环境、极薄的样品切片等才得以进行，对于活体生物的观察仍受到诸多限制。

直至近二十年来，各种“荧光显微术”的发展，使观测微观活体生物世界，有了崭新的研究方式。

由于生物细胞的胞器或生物分子等，并不尽然有显著的颜色差异，因此不能单纯仅依靠可见光与倍率放大来观察；因此，荧光显微术的核心原理是将外加的“荧光分子”，附着或接合在指定的生物分子上，如特定的蛋白质或特定的脂质等。由于这些特定的生物分子的分布，会与生物细胞内的结构有关，所以借由观察荧光的分布，我们就能了解生物细胞的微观结构。

2014 年，由 Eric Betzig、Stefan W. Hell 和 William Esco Moerner 等人荣获的诺贝尔化学奖，其重要性就是利用了荧光分子的化学特性，绕过了物理上绕射极限的阻碍，而达到超高解析度的生物影像。

如何看得小又快、久又深

但是，尽管有超高解析度的影像，并不尽然能表现出活体生物里的动态样貌。现有荧光技术中，常利用汞灯与雷射来激发荧光分子，但这些激发的能量，往往使荧光能显现的时间非常短，激发光的能量也会对生物分子造成伤害，也就是所谓的“光毒性”。

然而，若能够延长观测的时间与增加激发能量，则又可以观测到活体生物的动态表现、与更细致的现象；此外，多数超高解析度的显微技术，都局限在空间解析度的强化，而无法看到活体生物的立体结构与变化。

这些面向导致荧光显微术的发展，总是在这四个维度之中拉锯取舍：看得小（空间解析度）、看得快（时间解析度）、看得久（光毒性）与看得深（影像深度）。

光子预算 (photon budget) 的四个维度。活体生物影像总是在看得小、看得快、看得久与看得

为了实践活体生物分子的荧光显微观测，中研院陈壁彰助研究员师承 Eric Betzig ，与团队研发出“晶格层光显微术”，让光源只精准地照射到生物样品中所要观察的焦平面上，这样的照明方式，可以减少不必要的照明以减少光毒性，又因只照明到待观测的切面上，而能有效减少背景杂光。

如下图，传统的荧光显微术中，照明的光源是与观测视角同向的宽场光源 （widefield），使得观测样本整体都接受到激发光的能量，所要观测的焦平面上下范围，也因会被光源照射到，而产生背景杂光影响观测品质。

为了解决宽场光源这样过度照明的缺点，另一种“共轭焦显微术”是利用针孔 （pin-hole），让焦平面上的光源仅聚焦在极小的区域，但极小的焦平面上下的区域，仍然会被光照到而产生杂光。

荧光显微术的这两种照明方式，样品的背景区域皆会被光照到，而产生杂光。资料来源│陈壁彰提供 图说重

如下图，另一种传统平面层光照明的方式，则是将照明的方向与物镜观测的方向垂直（正交），使被照明的区域可以笼罩待观测的焦平面，但这样的照明区块仍然太厚。

对于以上的问题，利用“贝索层光照明”的方式，可以有效地改善。因为贝索光束能在焦平面上形成一条宽度仅有 0.5 m 的光束，使照明的光源仅照射到待观察的焦平面上，让影像拥有极佳的光学切面效果；再利用与光束垂直的观测物镜，以宽场成像的方式收集荧光。因此，只要在样本中移动贝索光束，就能逐条观测出待测样品的微观样貌。

传统平面层光照明，虽试着将光线聚焦于焦平面，然而其减少杂光的效果，还是不若贝索层光照明好。资料来

贝索层光照明动态示意：从Ｘ轴方向，利用单一贝索层光（蓝线）扫描样品（灰色块），获得切面（白色块）。

贝索层光照明动态示意：透过上下移动样品，就能观察到到不同深度的样品切面。资料来源│陈壁彰提供 图说重

用液晶荧幕图形，制造出数百条层光

但是对于活体生物来说，仅依赖一条贝索层光扫描，仍无法精准且即时地观测到生物体内的动态现象。因此，陈壁彰团队应用了“构造化照明显微术”（Structured Illumination Microscopy, SIM）的思维，先利用一个二维的光学晶格，来局限光的延展方向，而输出一层光；再利用自行开发的“空间光调变器”（Spatial Light Modulator, SLM），控制晶格纹路的呈现图形。

陈壁彰团队利用“空间光调变器”，可操控液晶荧幕上的图形，让雷射光穿过、制造出数百条贝索层光。摄影

空间光调变器，是一个由程式控制的液晶荧幕，荧幕上显示了由理论计算出来的相位图案，当入射的雷射光打到这个荧幕上的图案时，如同透过一个光栅，使雷射光产生绕射、生成数百条的层光。利用数百条贝索层光同时扫描样品时，仅需要“抖动”一下样品，就能完成一次完整的扫瞄。

此外，由于可利用程式控制液晶荧幕上的相位图案，因此研究者不会像传统光学实验一般，被所能取得的光栅元件特性局限，而能精细且多样化地微调出理想的层光状况。

比起使用“单一贝索层光”来逐行扫描，陈壁彰团队的方法不仅能维持良好的空间解析度，更因“数百条贝索层光”能快速完成扫描样品的特性，而让观测结果有良好的时间解析度。再者，也能因精准地使用较低能量的光束，而维持低光毒性，来对活体样本（例如细胞）进行长时间的追踪观测。

利用数百条贝索层光（蓝线）扫描样品（灰色块）时，仅需要些微“抖动”样品，就能完成一次完整的切面扫描（

为活细胞拍微影像

晶格层光显微镜“良好时空解析度”与“低光毒性”的特性，可以让研究者长时间观测微观生物世界的动态现象，例如：特别针对追踪细胞内单分子的动态，来理解生物体内某些反应机制；或如下方影片动态，利用每秒一次的频率完整扫描细胞，录制长达十分钟的影像，从而观察到细胞分裂的完整流程与细节。

晶格层光显微镜的问世，引起众多生物实验室的高度兴趣，特别是陈壁彰博士后时期的老师 Eric Betzig 非常强调显微镜的开发，一定要有生物学的“应用”！

因此，当晶格层光显微镜的第一版建置完成后，当时 Eric Betzig 特别要求陈壁彰租车开了 10 多个小时，将显微镜整组打包、载到一个研究乌贼神经网路的暑期工作营队中，将晶格层光显微镜介绍给其他研究社群，并陆续在一年内与 37 个不同生物实验室合作，观测了各式各样的生物样本。除了能快速累积实验资料以改善显微镜，也开启广泛接触到不同研究主题的契机。

左图为陈壁彰团队运用晶格层光照射的海拉细胞二维影像，右图是一般贝索光束。可以见到晶格层光能取得较细致

目前，晶格层光显微镜已从它众多的观测成果，被验证为观测活体生物的利器。然而晶格层光显微镜在面对深度较深的样品时，仍会因为样品本身的像差，而影响成像能力。且生物体中仍有太多不透明物质，会严重阻碍活体生物的观察。

2014 年回到台湾后，陈壁彰在中研院拥有自己的实验室，陈壁彰认为，未来的研究方向，除了引进在天文观测中，用以抵销大气影响的自适应光学 （adaptive optics） 概念以外，也须开发出对应的样品制备方式，例如利用化学方法将脂质替换掉，使样品透明化以便于显微观测。

相较于多数生物学界惯行的研究方法，“活体生物显微术”的概念仍相当新颖，其中对于活体的定义、样品的制备方式、与之对应的研究方法设计，都尚有研发与推广的空间。但无庸置疑的是，晶格层光显微镜的问世，已为观测微观世界的生命律动，洒下了百道一窥堂奥的洞察之光。