Nat Comm丨孙宇组发现肿瘤微环境中衰老细胞触发临床治疗抵抗新机制，为将来精准干预提供重要线索

责编丨迦溆

一个多世纪以来，临床医生和科学家们大多将治疗癌症的重点放在了癌细胞本身，例如利用各种药物来诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞的增殖和迁移。然而近年大量研究表明，肿瘤微环境在癌细胞增殖、扩散、转移以及对多种疗法的耐受性等方面也扮演着重要角色，那么这种所谓的肿瘤微环境到底是如何促进癌症发展的呢？

正如种子生长需要营养和水分充足的土壤一样，癌细胞要依赖于周围的环境才能在体内无限增殖。日前，中国科学院上海生命科学研究院孙宇课题组发现临床治疗过程中微环境内出现大量衰老细胞，后者成为持续性产生多种炎性因子的主要根源，其中一种名为SPINK1（serine protease inhibitor Kazal type I）的可溶蛋白通过基质细胞高度合成与胞外释放，源源不断进入受损的微环境空间，改变残存癌细胞表型并促进其获得耐药性，从而导致临床治疗抵抗。同时，外周血液中SPINK1含量的动态变化，同患者生存密切相关，可以作为将来临床预后与疗效评价的精确指标。相关研究结果以Targeting SPINK1 in the damaged tumour microenvironment alleviates therapeutic resistance为题发表在Nature Communications上。

癌症是导致人类死亡的一种重要疾病。癌细胞易对化疗药物和靶向药物等多种治疗方式产生不同程度的抵抗，因此寻找治疗失败的本质原因、开发新的治疗策略有着非常重要的意义。然而，即便目前全球较为流行、前景相当不错的免疫疗法，也仅仅对于一部分患者有效，实际情形是大约只有20%到40%的患者能对这类药物作出反应，而人们至今仍不清楚其中的缘由。这种技术性瓶颈，严重降低了临床治疗的成功率，更是阻碍现代医学发展的一个主要障碍。孙宇团队围绕肿瘤微环境和细胞衰老研究等方面的近期发现，为解释抗癌治疗效果不佳等实际问题给出了部分答案。

在这一工作中，研究人员首先根据全转录组数据深度分析，发现微环境中的基质细胞在经过放化疗等手段处理之后并不直接出现类似癌细胞的典型凋亡特征，而是随即进入另外一种状态，即细胞衰老。伴随这一变化的，则是以大量生成促炎因子为主要特点的衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）【1-3】（中国学者揭示细胞被动衰老以及衰老相关分泌表型调控新机制）。尽管人们对于SASP表达谱中大多数因子的生物功能和病理影响已经清楚，但个别分子在肿瘤进展中的意义仍属未知。其中表达幅度较为突出的SPINK1（serine protease inhibitor Kazal-type I，又名PSTI或TATI）是一种丝氨酸肽酶抑制因子。过往研究表明，SPINK1在人体中主要是抑制胰腺蛋白酶原的成熟性激活和随后酶活性的释放，而该因子的突变可以造成慢性胰腺炎，并向胰腺癌过度【4】。

在前列腺癌患者中，SPINK1的表达与ETS gene fusion为相互排斥事件。SPINK1在癌细胞中的表达水平同患者临床预后呈显著负相关。SPINK1作为outlier的表达可以作为前列腺切除手术之后患者biochemical recurrence的一个独立预测因子【5，6】。虽然这一现象被美国University of Michigan的Arul Chinnaiyan的研究小组发现于大约十年前，该实验室后来也进行了一系列的深入研究，但仍然集中于前列腺癌上皮细胞，并未考虑来自微环境的影响。

相比之下，孙宇团队的数据表明，大多数造成DNA damage的药物包括电离辐射本身均能诱导SPINK1在人源基质细胞中大幅上调。胞内合成的同时，SPINK1被大量外泌并进入胞外液。更重要的是，SPINK1在基质细胞中的表达规律，同其它的典型SASP外泌因子具有高度相似性，即药物处理之后的7-10天逐渐进入一个平台期，并同细胞衰老的生化特征相互对应，此后便并长期保持活跃合成与高度外泌。相比于基质细胞，相同组织来源的上皮细胞，则呈现出较弱的药物损伤诱导性，无论转录还是蛋白水平都十分有限。

这种来源于组织微环境的SPINK1，究竟有何重要意义？研究人员随后对常见的实体瘤进行了分析。在一个前列腺癌临床队列中，他们发现化疗后阶段的患者体内出现了明显的SPINK1蛋白，这与化疗前时期形成鲜明对比。更为重要的在于，SPINK1蛋白在病灶中的表达，集中体现于腺体周边的基质组织，而非人们平时最关注的腺体中的上皮癌细胞。根据基质细胞中其它蛋白表达水平或者活化程度进行类似的病理分级之后，结果显示SPINK1的表达同已知的SASP表型的两个典型标记物IL-8和WNT16B的表达状态呈现密切关联。同时，SPINK1在基质细胞中的表达水平越高，患者的临床预后越差，生存期越短，暗示SPINK1具有显著的病理意义。

既然SPINK1作为基质细胞可诱导表达的广谱SASP一员，对于微环境中的癌细胞是否可以产生显著影响呢？随后的co-culture实验表明，前列腺癌细胞在SPINK1的作用下发生RTK受体蛋白EGFR的活化，以及其下游信号通路Akt-mTOR和Erk-Stat3的磷酸化。IP结果证实了SPINK1与EGFR之间的物理性结合。相比于基质细胞本身在敲除或过表达SPINK1之后的增殖状态，癌细胞出现了多种表型的显著变化，包括增值率、迁移率和侵袭性。更重要的，基质细胞来源的SPINK1造成上皮癌细胞出现显著耐药性，其剂量反应曲线出现明显的平行漂移。研究人员选用的米托蒽醌(MIT)药物浓度同前列腺癌临床患者血浆浓度十分接近，就是为了设计与模拟这种给药条件下SPINK1的病理影响。

通过RNA-Seq发现，相比于对照组基质细胞CM，SPINK1阳性CM，可以深刻改变癌细胞的表达谱。PC3和DU145这两个细胞系中出现protein-coding, lncRNA, miRNA, misc RNA和pseudogene等category的普遍变化。在PC3和DU145之间差异表达的基因有465个；在对这些分子进行系统分析之后发现，GO变化最显著的是免疫应答、信号转导和细胞通讯等方面。癌细胞在基质细胞来源的SPINK1作用下除了出现EMT和肿瘤干细胞发展（CSC development）表型切换的同时，更呈现出血管再生类似的一系列相关变化，包括CD31和CD34等分子在转录本和蛋白水平均出现显著上调。表达位点生信分析和体外管生成实验检测均证实了癌细胞这一血管生成的惊人趋势。

在对免疫缺陷型荷瘤小鼠进行的体内实验中，SPINK1可以加快前列腺癌的发展速度。以MIT为主的化疗药物可以造成癌细胞组的终端体积显著下降，但在基质细胞同时存在的情况下，肿瘤滞留体积却大幅上升，暗示微环境在治疗过程中赋予残存癌细胞显著的获得性耐药。用药治疗荷瘤小鼠的过程中，一些SASP典型外泌因子如IL-8/WNT16B/SPINK1/MMP3/AREG/ANGPTL4，以及衰老相关marker如p16/p21的表达均出现上调，暗示体内条件下细胞衰老和SASP的发生发展。

为了抵消随着化疗的进行而出现的肿瘤微环境中的SPINK1，研究人员使用了SPINK1的单克隆抗体，以及已被美国FDA批准的、临床中用于阻断EGFR的西妥昔单抗Cetuximab。有趣的是，化疗/SPINK1单抗联用造成的治疗效果，甚至要高于化疗/Cetuximab联合的效果。这无论在小鼠肿瘤终端体积还是体内生物荧光信号的检测上，都获得了一致性数据。更重要的是，对肿瘤切片进行组化分析时，他们发现化疗/SPINK1单抗联用可以造成比化疗/Cetuximab联用更高的癌细胞凋亡率，暗示微环境中的SPINK1在受体癌细胞表面可能不止EGFR这一个受体【7】。

随后的临床研究数据表明，SPINK1可以在化疗后阶段的患者血浆中被检测到，其水平显著高于化疗前时期的那些患者。此外，SPINK1同IL-8在同一批患者一对一的分析中处呈现出一定程度的关联。免疫印迹显示出这两个外泌因子在患者血浆中几乎同时出现，且化疗后阶段同化疗前时期之间形成鲜明对比。在原位肿瘤、外周血液之间的定量分析，进一步揭示了SPINK1和IL-8之间存在密切关联，暗示局部微环境中的这些SASP因子最终要进入循环系统并可以作为临床治疗过程中评估癌症患者体内SASP发生发展的新型标记物。

相比于过往有关SPINK1在癌细胞中的高表达、突变、扩增和缺失等报道，这项研究深刻揭示了肿瘤微环境中的基质细胞在化疗过程中可以生成与释放大量的SASP因子，其中的SPINK1可以激活疗后阶段残存下来的癌细胞，使其获得对于临床药物的抵抗。这种获得性耐药，正是造成日后肿瘤复发和转移的生物学基础，也成为患者在临床中出现多药耐药等现象的重要病理根源【8】。

据悉，孙宇组博士生陈斐、复旦大学中山医院泌尿外科龙启来、同济大学上海第十人民医院符达和复旦大学中山医院普外科朱德祥为共同第一作者，孙宇研究员为该文通讯作者。

参考文献

1. Coppe JP, Patil CK, Rodier F, Sun Y, Munoz DP, Goldstein J, et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 2008;6(12):2853-68.

2. Acosta JC, O'Loghlen A, Banito A, Guijarro MV, Augert A, Raguz S, et al. Chemokine signaling via the CXCR2 receptor reinforces senescence. Cell. 2008;133(6):1006-18.

3. Kuilman T, Michaloglou C, Vredeveld LCW, Douma S, van Doom R, Desmet CJ, et al. Oncogene-induced senescence relayed by an interleukin-dependent inflammatory network. Cell. 2008;133(6):1019-31.

4. Vue PM, McFann K, Narkewicz MR. Genetic Mutations in Pediatric Pancreatitis. Pancreas. 2016;45(7):992-6.

5. Tomlins SA, Rhodes DR, Yu J, Varambally S, Mehra R, Perner S, et al. The role of SPINK1 in ETS rearrangement-negative prostate cancers. Cancer cell. 2008;13(6):519-28.

6. Laxman B, Morris DS, Yu J, Siddiqui J, Cao J, Mehra R, et al. A first-generation multiplex biomarker analysis of urine for the early detection of prostate cancer. Cancer research. 2008;68(3):645-9.

7. Ateeq B, Tomlins SA, Laxman B, Asangani IA, Cao Q, Cao X, et al. Therapeutic targeting of SPINK1-positive prostate cancer. Sci Transl Med. 2011;3(72):72ra17.

8. Maman S, Witz IP. A history of exploring cancer in context. Nature reviews Cancer. 2018;18(6):359-76.