专家解读丨Science发文展望CRISPR-Cas技术未来的应用前景

撰文丨李潇飒、陈佳（上海科技大学生命科学与技术学院）

责编丨迦溆

自20世纪70年代重组DNA技术的出现起，DNA编辑技术不断发展并趋于成熟。科学家们可以通过改造特定的基因来研究基因功能、遗传病的发病机理、开发新药以及用于基因治疗和改良作物等等。真核生物的基因组含有几千万至上亿个碱基对，难以在特定的位点展开编辑。锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）、转录激活因子样效应因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）和近几年出现的CRISPR-Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas）大大促进了真核生物基因编辑的发展。

2018年8月31日，Jennifer Doudna教授以“CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering”为题在Science杂志上在线发表了一篇综述，概括了CRISPR-Cas系统的工作原理，全方位地介绍了基于CRISPR-Cas系统的种技术的发展和应用，并展望了CRISPR-Cas技术未来的应用前景。

CRIPSR-Cas系统广泛存在于细菌中，是细菌的一种适应性免疫系统，可以帮助细菌有效识别和切割入侵的外源核酸。CRISPR-Cas系统可以将外源DNA片段捕获插入到细菌基因组CRISPR-array中，转录产生CRISPR RNA（crRNA）后，引导Cas核酸内切酶识别外源核酸进行切割（图1）。CRISPR-Cas系统包含三种类型：I型，II型和III型。I型和III型系统较为复杂，需要多个Cas蛋白形成复合物开展切割；而II型系统仅需要一个Cas蛋白即可进行切割，目前广泛应用的Cas9蛋白就属于此类型。在CRISPR-Cas9系统中，crRNA与tracrRNA结合后同Cas9形成复合物。复合物中的Cas9识别靶位点临近的PAM序列，crRNA识别靶位点，并形成稳定复合物；进而Cas9内切酶活性被激活，切割DNA从而产生双链断裂【1】。其中crRNA与tracrRNA可被人为改造成sgRNA（single guide RNA），进一步简化了CRISPR-Cas系统【2】。另外，Cas12a（Cpf1），Cas13a（C2c2）等其他类型的Cas蛋白也相继被发现【3，4】，进一步丰富了CRISPR-Cas系统。

图1. CRISPR-Cas系统的工作机制

CRISPR-Cas系统和基于CRISPR-Cas的各种衍生技术也广泛的应用在生命科学和医学领域。Cas9和Cas12a可以在多种类型的细胞和组织内实现有效的特定基因的敲除，以此研究基因功能；通过结合全基因组筛选，可以帮助新药开发和小分子活性鉴定。近年来发展出的碱基编辑器（Base editor）系统，把失去活性或者保留单链切割活性的Cas蛋白与核酸脱氨酶连接，可以在不产生双链断裂的情况下开展单碱基编辑【5-7】（图2）。相较于传统的同源重组技术，碱基编辑的出现使得CRISPR-Cas系统在碱基转换方面的效率大大提高，并有望矫正与疾病相关的碱基突变。

失去活性的Cas9 （dCas9）结合不同的DNA调节蛋白，可以调控基因表达活性或染色质状态（图2）。如结合TET1（DNA甲基化羟化酶）可以特异性催化DNA的去甲基化，从而调节基因的表达。RNA调节蛋白也可通过与失活的Cas13蛋白结合实现对RNA的调控（图2）。若将调节蛋白换成荧光蛋白，可以对特定DNA或RNA分子进行实时成像（图2）。

图2.CRISPR-Cas系统的应用

此外，有研究发现Cas13 和Cas12a蛋白在切割靶序列之后，可任意切割细胞内其他RNA或单链DNA（collateral cleavage）。基于这一特点，张锋团队开发出了病毒检测系统，命名为“SHERLOCK”（Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOKing），实现了快速灵敏的病毒检测。“SHERLOCK”系统除了包含Cas13以及对应的靶向待检测病毒的crRNA外，还包含一个切割后可发出荧光的报告RNA链。当这些Cas蛋白识别到靶向DNA链时，其collateral cleavage被激活，从而切割报告RNA并释放可检测的荧光信号【8】。在第二代SHERLOCK系统中，张锋团队进一步增加了Cas蛋白的种类，可以同时检测多种目标；并利用额外的CRISPR相关酶放大其检测信号，使得其灵敏度进一步增加【9】。

近期，Science杂志上发表的两篇CRISPR相关文章“Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR”和“Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space”分别在CRISPR-Cas系统的应用和Cas蛋白的优化方面为我们提供了新思路。第一篇文章中，George M. Church 团队利用CRISPR-Cas技术建立了携带遗传条形码的小鼠，利用不断变化的条形码成功追溯了小鼠细胞的发育过程（Science丨小鼠发育DNA 条形码的建立）。而第二篇文章中，Osamu Nureki团队分析了Cas9与DNA复合物的结构，通过不断的探索，成功改造出了识别“NG”PAM序列的Cas9，使得Cas9在基因操作上的应用范围大大增加。

尽管CRISPR-Cas领域发展得非常迅猛，与其相关的技术还有很多问题亟待解决，如脱靶效应、效率不高等。针对这些问题，科学家们一直在寻找新的解决方法，如开发更精确的脱靶效应检测方法、修饰Cas蛋白或sgRNA从而提高复合物的稳定性、尝试新的转染方法（如核注射sgRNA与Cas9复合物）等等。

CRISPR-Cas为我们观察、调控和编辑基因组提供了更为简洁和直接的方法，它的出现大大促进了生命科学和医学领域的相关研究。相信在不久的将来，CRISPR-Cas技术可以更好地应用于临床研究，推动基因治疗的发展。

注：陈佳博士现为上海科技大学生命学院PI，近期连续以通讯作者身份在Nature Biotechnology（2篇）、Nat Struct Mol Biol、Cell Res等杂志上发表多篇基因编辑技术相关论文（Nature Biotechnology丨陈佳/黄行许/杨力合作组开发出普适型碱基编辑器；Nat Biotech丨上科大、中科院联合开发新型碱基编辑器；关乎基因编辑的精准性丨APOBEC3介导的DNA修复在CRISPR/Cas9基因编辑过程中产生突变的新机制）。

原文链接：https://science.sciencemag.org/content/361/6405/866（可点击文末“阅读原文”）

参考文献

1. Hsu, P.D., E.S. Lander, and F. Zhang, Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 2014. 157(6): p. 1262-78.

2. Jinek, M., et al., A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science, 2012. 337(6096): p. 816-821.

3. Abudayyeh, O.O., et al., C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science, 2016. 353(6299): p. aaf5573.

4. Zetsche, B., et al., Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 2015. 163(3): p. 759-71.

5. Gaudelli, N.M., et al., Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 2017. 551(7681): p. 464-471.

6. Komor, A.C., et al., Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016. 533(7603): p. 420-4.

7. Li, X., et al., Base editing with a Cpf1-cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2018. 36(4): p. 324-327.

8. Gootenberg, J.S., et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 2017. 356(6336): p. 438-442.

9. Gootenberg, J.S., et al., Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science, 2018. 360(6387): p. 439-444.