重磅突破！首个bTMB验证性文章发表

整理：肿瘤资讯

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近年来，免疫治疗引领了肿瘤治疗的重大变革。在PD-L1高表达或高肿瘤突变负荷（TMB）的患者中，免疫治疗的疗效更为显著。TMB的传统检测方法是全外显子测序（WES），那么靶向测序是否可以准确检测TMB？一项在10万例肿瘤患者中进行的大型验证性研究证实，FoundationOne️® assay可以准确评估TMB，FoundationOne️®assay和WES检测的TMB高度相关。然而上述方法使用的是组织样本，为了解决晚期肿瘤患者组织样本难以获取这一问题， Foundation Medicine Inc.（FMI）与基因泰克近日联合开发了一种基于外周血检测TMB的方法（bTMB），通过严谨的验证分析证实其可以准确检测TMB，同时在大样本临床试验中进一步证实了bTMB的应用前景，结果发表在Nature Medicine杂志。这是首次证实bTMB可准确重复测量，并且与免疫检查点抑制剂的疗效相关。本刊对该研究进行全面梳理，并特邀中国人民解放军总医院胡毅教授进行点评，以飨读者。

靶向测序FoundationOne️® assay检测TMB的验证分析

TMB传统检测方法是全外显子测序，那么靶向测序是否可以准确检测TMB？一项发表在Genome Medicine上的研究对这一问题进行了深入探索。

1．FoundationOne® assay和WES检测TMB结果高度一致

该研究首次探索了采用靶向315个基因（1.1Mb的编码基因）的全面基因组测序（CGP，FoundationOne® assay）评估整个外显子区的TMB的准确性。首先对29个肿瘤组织标本进行FoundationOne® assay检测和全外显子组测序（WES），计算体细胞编码区每百万碱基的碱基置换和插入缺失突变数。使用WES对肿瘤组织和正常组织进行测序，以区分体细胞突变和胚系基因多态性。FoundationOne® assay没有配对的正常组织，但对基因变异进行了严格的筛选以排除胚系基因多态性。结果显示采用两种方法计算的TMB高度相关（R2=0.74；见图1a）。接下来，研究者评估了FoundationOne® assay检测TMB的可重复性。对60例接受FoundationOne® assay检测的标本进行多次检测，比较同一标本TMB检测的重复性。结果显示，各次检测的TMB高度相关（R2=0.98；见图1b），提示FoundationOne® assay可以准确检测TMB。此外，研究者还进一步在更大样本量的患者中分析了FoundationOne® assay和WES检测TMB的一致性。纳入35项研究的8917例肿瘤标本的WES数据计算TMB，同时计算FoundationOne® assay检测的315个基因的突变数，与预期一致，两种方法计算的TMB高度相关（R2=0.98）。这一结果证实，采用FoundationOne® assay靶向整个编码区的几百个基因可以准确评估整个外显子区的突变负荷。

图1. 采用FoundationOne® assay 检测TMB的精确性评估

2．揭示肿瘤TMB全貌

研究者同时采用FoundationOne® assay评估FMI实验室中进行临床常规检测的102292例组织标本的TMB，这些组织标本来源于541种不同的肿瘤。整个队列中，TMB的中位数为3.6m/Mb（范围：0-1241m/Mb），这与既往采用WES检测估计的TMB相符。其中，167种不同癌症类型（每种至少50个标本）的TMB分布见图2. 不同类型癌症患者中位TMB存在较大差异，从0.8m/Mb至45.2m/Mb。与预期相符，有显著突变暴露的癌症，如肺癌和黑色素瘤，TMB更高（中位TMB分别为7.2m/Mb和13.5m/Mb），目前免疫治疗已获批用于黑色素瘤，NSCLC和膀胱癌等高TMB瘤种。TMB检测还有助于发现其他高TMB，可能从免疫治疗中获益的瘤种，如皮肤鳞癌，小细胞肺癌，弥漫性大B细胞淋巴瘤等。

图2. 不同瘤种中TMB的分布

然而，组织TMB检测对样本质量要求高，如果能够开发一种新的测定TMB的方法，通过检测血液来源的ctDNA对TMB测定，将具有非常重要的临床意义。

开发bTMB检测平台，并在POPLAR和OAK研究中验证其临床价值

为了克服组织取材的困难和不足，FMI与基因泰克联合开发了一种基于外周血检测TMB的方法（bTMB），并评估bTMB能否预测atezolizumab的临床疗效。研究者首先采集10ml外周血，为保证分析结果的准确性，20到100ng的cfDNA用于测序文库的构建，ctDNA中最高的体细胞突变频率不能低于1%。接下来，采用FoundationOne® CDx NGS assay检测1.1 Mb的基因编码序列，在排除常见的胚系多态性和驱动突变后，计算bTMB。并探索采用不同的bTMB分界值进行分组，以POPLAR研究为训练集，OAK研究为验证集，预测atezolizumab疗效的bTMB最佳cut-off值，研究流程图见下图3。

图3. 研究流程图

1. bTMB能可靠的反映肿瘤组织的突变负荷吗？

为评估bTMB法在临床样本中的检验效能，研究者对比了POPLAR和OAK研究中的组织样本与患者治疗前收集到的血浆样本bTMB的结果。来源于同一个患者的tTMB（组织）和bTMB（血浆）呈显著正相关（Spearma秩相关系数=0.64；95%CI：0.56-0.71），阳性一致率（PPA）为64%，阴性一致率（NPA）为88%，见下图4。

图4. tTMB与bTMB高度相关

是什么导致bTMB和tTMB的差异呢？原因可能包括：1）实验因素（分析方法和实验平台），tTMB同时计算等位基因频率≥5%的单核苷酸变异（SNV）和插入和缺失（等位基因）变化，而bTMB只计算等位基因频率≥0.5%的SNV；2）NSCLC的瘤内异质性，单个部位活检组织标本的突变谱可能与释放入血液的ctDNA突变有显著差异；3）样本特征上可能存在差异，例如DNA来源（福尔马林固定石蜡包埋的组织来源的DNA与ctDNA）、收集时间、样本类型（活检与切除）、诊断阶段、组织纯度、ctDNA最大体细胞等位基因频率（MSAF）和ctDNA输入质量，都可能导致TMB结果的差异。

在上述众多的可能因素中，哪一个因素占主导呢？研究者采用69个细胞系的cfDNA同时采用FoundationOne® assay和bTMB 平台检测，以确定bTMB和tTMB结果的差异是否源于技术平台。结果显示两者间一致性高达0.93，如下图5所示。这就说明，实验因素只是导致两种不一致性的次要因素，而生物因素（样本本身存在的差异）才是主要原因。

图5. 采用细胞系cfDNA同时进行F1 assay和bTMB 平台检测，相关性高达0.93

为了证实bTMB平台检测变异位点的有效性，研究者还选择了临床样本和细胞系，同时使用bTMB平台和FACT（FMI已经做过验证的一款血检NGS平台）检测。结果显示，阳性一致率（PPA，bTMB阳性/FACT阳性）为93.4%，假阴性来源于0.5%到1.1%低频变异；阳性预测值（PPV，FACT阳性/bTMB阳性）为93.5%，假阳性来源于0.76%，0.82%，1.56%，位于单碱基串联重复区域。进一步检测等位基因突变频率（VAFs），对比两个平台的一致性。结果显示，两者一致性很高R2 = 0.998；仅当VAF较低时，一致性相对降低（R2=0.6783），如下图6所示。

图6. bTMB和FACT共同检测区域的检测结果一致性较高

肿瘤的异质性是否会影响血液和组织TMB的检测结果呢？研究者对22例NSCLC患者组织和血浆ctDNA中检测到的变异位点进行比较。结果显示，在TMB和bTMB数目均大于30的样本对中，平均有1/3的变异是ctDNA中特有的，1/4的变异是组织样本特有的，其他的是两者均有的（1-1/3-1/4=0.42）。 22例患者中，7例患者ctDNA中检测到的变异位点很少，和组织的一致性相对较低，见下图7。

图7. bTMB检测和TMB检测位点的一致性分析

综上可知，实验平台和生信分析方法本身对ctDNA和组织中变异位点不一致的影响较小，差异主要来源于样本本身。肿瘤异质性是引起TMB和bTMB不一致的主要原因。此外，ctDNA含量，血浆和组织的取样时间间隔，也是影响ctDNA和组织中变异位点不一致的重要因素。

2. 以POPLAR研究为训练集，探寻bTMB作为预测标志物的最佳cut-off值

采用上述bTMB平台检测，是否可以预测免疫治疗的疗效？研究者首先对POPLAR研究中211例有合格的血浆标本的患者进行bTMB检测，定义为可评估标志物人群（biomarker evaluable population，BEP）。分别采用不同的bTMB分界值进行分组分析，结果显示，在bTMB≥10，≥16 和 ≥ 20的患者中均观察到atezolizumab组的PFS和OS获益增强，但在bTMB ≥16水平有最佳表现 PFS （HR = 0.57；OS HR = 0.56），见下图8所示。最终确定以bTMB≥16作为cut-off值，并在III期研究OAK中进行验证。

图8. POPLAR研究中PFS和OS HR的森林图：a. PFS；b.OS。

3. OAK研究确认bTMB可以作为预测免疫治疗疗效的非侵入性标志物

在OAK研究中583例患者有合格的血浆标本可以进行bTMB检测，这些患者定义为BEP人群。其中，bTMB≥16的患者占27%（N=158）。在bTMB≥16的亚组中，atezolizumab组患者的PFS显著优于多西他赛（HR 0.65；95%CI：0.47-0.92；P=0.012），见图9a-c。在OAK研究中，bTMB≥16的患者亚组和BEP人群的OS获益相当（HR 0.64；95%CI：0.44-0.92；P=0.017），这可能是受到患者进展后的后续治疗影响。在bTMB≥16亚组中，atezolizumab组和多西他赛组的中位OS分别为13.5个月和6.8个月，见图9d-f。

图9. OAK研究中bTMB与患者临床结局的关系

4. OAK研究中，bTMB和PD-L1表达的相关性

研究者进一步分析了OAK研究中同时检测了bTMB和PD-L1表达的229例患者，结果显示， bTMB≥16亚组和PD-L1高表达的患者重叠比例较少，见图10。疗效相关分析显示，对比与bTMB≥16或TC3/IC3的患者，bTMB≥16且TC3/IC3的患者从atezlizumab治疗中获益最大。

图10. bTMB和PD-L1表达的相关性

bTMB可作为tTMB检测的重要替代手段，将在前瞻性研究中进一步验证

随着越来越多治疗靶点的发现，大panel多基因检测已经成为临床基因检测的新趋势。FoundationOne®assay靶向肿瘤编码区的315个基因，不仅可以全面检测患者潜在的治疗靶点，同时准确提供TMB信息，为探寻免疫治疗优势人群提供重要参考。为克服组织检测的局限性，FMI进一步开发了bTMB检测平台，并首次证实采用血浆可以准确和重复检测TMB。目前，正在进行两项前瞻性的研究B-F1RST及BFAST研究，在晚期NSCLC一线治疗中前瞻性验证新bTMB检测的临床应用前景。

胡毅主任医师、教授、博士生导师

中国人民解放军总医院临床试验药理基地肿瘤专业组负责人

解放军总医院呼吸肿瘤及内镜介入专科主任

美国华盛顿大学访问学者

中央保健委员会会诊专家

中央军委保健委员会会诊专家

中国研究型医院学会分子肿瘤与免疫治疗专业委员会主任委员

北京乳腺病防治学会对外合作部主任及国际医疗与合作专业委员会名誉主任

北京乳腺病防治学会肿瘤免疫治疗专业委员会主任委员

中国医药教育协会肿瘤免疫和靶向治疗专业委员会副主任委员

中国研究型医院学会肿瘤专业委员会副主任委员

中国宋庆龄基金会肿瘤医疗及产学研联盟副理事长

中华医学会肿瘤分会委员

中华医学生物免疫学会常务理事

国家自然科学基金委员会评审专家

专家点评

近年来，随着PD-1/PD-L1抑制剂的临床研究及临床应用的不断深入，如何确定有效及可靠的生物标志物，以帮助临床医生筛选出适合该治疗的患者是肿瘤免疫治疗面临的重要课题。目前，PD-L1的表达和TMB是目前比较公认的免疫治疗疗效预测标志物。在肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、血液肿瘤等多个瘤种的临床研究结果表明，TMB可以预测PD-1/PD-L1抑制剂的治疗。既往TMB检测需要采用进行全外显子测序，检测比较耗时且成本较高。FMI在10万例肿瘤标本中进行验证，结果显示采用FoundationOne®也可以准确检测TMB，与全外显子测序结果高度相关。然而，无论是全外显子测序还是FoundationOne®检测，都需要患者提高足够、高质量的组织标本。但临床实践中，约30%的晚期NSCLC患者，无法进行组织活检。既往我们已经开展了很多采用液体活检来进行分子突变检测，如EGFR突变等。能否采用血浆进行TMB的检测呢？这引发了研究者的兴趣。目前，我们已经看到了这方面的探索，研究者首先对bTMB检测平台进行严谨的验证，证实bTMB能可靠的反映肿瘤组织的突变负荷。接下来对POPLAR和OAK研究中的患者进行探索性分析，结果显示bTMB与atezolizumab疗效显著相关，bTMB可预测患者的PFS和OS获益。这是首项针对血液检测TMB的研究，并明确了检测的可行性；因此在技术和理念上都是一大进步。但值得注意的是，这仅是一项回顾性的探索性研究，尚不足以改变临床实践。让人欣喜的是，肿瘤研究者们的理念创新，行动敏捷，目前已经开展了前瞻性的临床研究（B-F1RST和BFAST 研究）对bTMB检测平台进行临床验证。毋庸置疑，这是一个非常具有有前景的研究方向。我们期待精准治疗时代，免疫治疗也能更加精准。

参考文献

1. Analysis of 100,000 human cancer genomes reveals the landscape of tumor mutational burden. Genome Medicine (2017) 9:34

2. Blood-based tumor mutational burden as a predictor of clinical benefit in non-small-cell lung cancer patients treated with atezolizumab. Nature Medicine 2018.

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