这项研究打破细胞-结构生物学边界，看见“渐冻人”细胞内病变的结构基础

低复杂度蛋白质聚集是神经退行性病变的重要标志。现在，一份此种聚集的高分辨率结构快照史无前例地呈现在我们面前，揭示出这些蛋白质对重要细胞功能的破坏。

撰文 Laura Pontano Vaites & J. Wade Harper

翻译寒雨

审校赵维杰郭强

神经退行性疾病常常与短核苷酸重复序列插入的基因突变有关。在肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS，亦称运动神经元病、渐冻症）和额颞叶痴呆中，C9orf72 基因非编码区的短重复序列插入 1,2会产生含有甘氨酸（G）和丙氨酸（A）残基重复序列的异常翻译产物。这些 poly-GA 产物在神经元中形成聚集。既有研究显示，这些聚集会阻碍蛋白酶体复合物降解蛋白质这一关键细胞活动3,4。然而，对于这种破坏产生的生化基础及其致病机制，我们仍然知之甚少。在这篇 Cell 文章中，郭强等人5利用 3D 冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）精确地绘制了神经元中 poly-GA 聚集和相关大分子复合物的组织和结构特征，将 poly-GA 对蛋白酶体的破坏直观地展现出来。

3D cryo-ET 使用电子显微镜从不同角度对一个超薄、冷冻、含水的细胞切片进行观察，并由此重构出三维立体图像。作者利用 3D cryo-ET 实现了神经元的可视化，这些神经元经过遗传改造，表达包含 175 个或 73 个拷贝的 poly-GA 片段。这些片段带有绿色荧光蛋白标签，可以被光学显微镜精确定位。在体内，C9orf72 扩增需要很长时间来形成 poly-GA 片段，而这些工程蛋白可以有效地对内源 poly-GA 片段进行模拟。作者发现，poly-GA 蛋白呈高度簇状，由厚度相对均匀，但长度和宽度存在差异的纽带结构组成并时常具有二叉状分支结构，这一结果与先前常规电子显微镜的体外观察结果相似 6。

这项工作不仅观察了细胞中 poly-GA 聚集的详细结构，而且将 poly-GA 结构与 poly- Q 结构进行了比较。Poly- Q 是另一种基因异常扩增形成的聚集，可导致另一种神经退行性疾病：亨廷顿病。2016 年，该研究组已经完成了对其结构的 3D cryo-ET 分析 7。这种比较揭示出的结构差异，可以帮助研究者对两种聚集致病机制的差异进行解读。

首先，两种聚集本身的结构是不同的。poly- Q 形成纤维状聚集，与 poly-GA 聚集相比，它很少分支，致密程度也更低 7。

其次，当作者使用计算手段，在聚集中搜寻已知的大分子复合物时，他们发现许多蛋白酶体被募集到了 poly-GA 聚集中（图 1）。而生化数据也表明，神经元中多达 50% 的蛋白酶体复合物都被募集于 poly-GA 纽带结构中。将蛋白酶体通过这种隔离机制从其在细胞中的正常位置移除，或许可以解释含有聚集的细胞中蛋白酶体活性的降低 4,8。核糖体是介导蛋白质合成的复合物，其大小与蛋白酶体相当，但极少存在于 polyGA 聚集物中，这表明蛋白酶体会主动招募 poly-GA 聚集或主动保持与 poly-GA 聚集的结合。poly- Q 纤维却与之不同，它不含蛋白酶体，但与多种细胞器的膜结构紧密接触，这种相互作用可以导致内质网等细胞器的膜结构发生形变。这种形变则可能影响蛋白质的翻译、运输和降解途径7。

图 1 聚集毒性产生机制的对比。a, 与一大类 ALS 相关的 poly-GA 在神经元中形成聚集。作者 5通过细胞内高分辨率结构，展示了与蛋白酶体（图中为蓝色）结合的由 poly-GA 形成的带状聚集（图中为红色）。蛋白酶体参与其他蛋白质的降解过程，它被 poly-GA 聚集捕获并处于功能停滞状态，从而导致细胞毒性。Poly-GA 聚集不与囊泡和内质网等具膜细胞器结合。b, 但与亨廷顿病相关的 poly- Q 聚集呈纤维状（图中为紫色）7，这些聚集使囊泡膜和内质网膜产生形变。这些结果表明不同的聚集可以通过不同的机制引起神经退行性改变。

蛋白酶体由桶状的核心亚基（蛋白质底物的切割降解在此发生）和一个或两个调节亚基组成，这些调节亚基覆盖在桶的末端，形成其盖子，对试图进入蛋白酶体内部的分子进行限制，保证只有携带泛素标记的蛋白才能进入。在既有研究中，研究者曾观察到调节颗粒的多种构象 9,10，表明蛋白酶体会在基态、准备态和底物结合态之间发生循环性的构象变化。作者使用计算方法对蛋白酶体图像进行平均，从而判断图像中蛋白酶体的状态（相关技术参考文献 11）11，发现在 poly-GA 聚集内同时存在基态和底物结合态的蛋白酶体。他们还发现，与不含 poly-GA 产物的对照组神经元相比，表达 poly-GA 的神经元中具有两个调节亚基的蛋白酶体的比例大幅增加。聚集中接近四分之一的蛋白酶体都与一种近期解析的蛋白酶体构象9一致，在这种构象下，蛋白酶体与底物结合，但底物被困于蛋白酶体核心亚基中，使蛋白酶体的功能处于阻滞状态。而在那些与 poly-GA 纽带最为接近的蛋白酶体中，处于阻滞状态的蛋白酶体比例更高，达到 36%。

为什么会发生这种阻滞？在重建的断层图像中，作者在 poly-GA 纽带和蛋白质 RAD23 与蛋白酶体的结合位点之间发现了许多有电子密度分布的区域。 RAD23 参与将泛素标记的蛋白底物募集到蛋白酶体的过程，并且会在 poly-GA 聚集中富集 8。由此推断，这些电子密度可能代表着与聚集内 RAD23 结合的泛素化标记的蛋白底物。研究者尚不清楚“噎住”蛋白酶体的究竟是哪些蛋白，但 poly-GA 片段本身很可能就是其中之一，并通过这种途径直接导致了蛋白酶体活性的降低。不管具体机制如何，细胞内蛋白酶体活性的降低都会对蛋白质降解途径有害，并由此导致细胞毒性。

这些结果又引出了几个需要回答的重要问题。

首先，由 C9orf72 扩增诱发的 ALS 被认为与 poly-GA 聚集形成以及 C9orf72 蛋白产物的减少都有关系，但这两种机制所造成的影响各有多大？C9orf72 蛋白参与形成细胞自噬相关的复合物 12。细胞自噬是细胞内蛋白质等组分被降解和循环利用的过程。因此，C9orf72 蛋白水平的降低可能与 poly-GA 依赖的蛋白酶体抑制共同增加了神经元毒性。

其次，poly-GA 聚集对其他蛋白质的捕获是否也会增加细胞毒性？在 poly-GA 聚集中富集的自噬相关蛋白 p62 就是进一步的研究对象之一 8。

第三，与聚集解聚相关的几种分子机器都没有在 poly-GA 结构中富集，其原因尚不清楚。

最后，poly-GA 是由 C9orf72 扩增产生的表达量最高的重复序列蛋白，但不是唯一一种——突变也可以产生甘氨酸 - 精氨酸（poly-GR）和脯氨酸 - 精氨酸（poly-PR）聚集。这些其他聚集的结构与 poly-GA 相比如何？大多数关于 poly-GR 和 poly-PR 聚集的既有数据认为它们不会缠结蛋白酶体，这意味着它们通过其他机制产生毒性 13,14。

进一步的 3D cryo-ET 研究，以及对于 C9orf72 插入突变序列的天然翻译产物，而非本研究中使用的构建蛋白产物进行深入分析，可能会澄清患者体内聚集与研究中使用的模型聚集之间的异同。

概括而言，此项工作以前所未有的分辨率，使用 3D cryo-ET 实现了对细胞内基本进程的可视化观测 11。此外，它为理解聚集相关神经退行性疾病的复杂机制奠定了新的基础。

参考资料

1. DeJesus-Hernandez, M. et al. Neuron 72, 245–256 (2011).

2. Taylor, J. P., Brown, R. H. Jr & Cleveland, D. W. Nature 539, 197–206 (2016).

3. Yamakawa, M. et al. Hum. Mol. Genet. 24, 1630–1645 (2015).

4. Zhang, Y.-J. et al. Acta Neuropathol. 128, 505–524 (2014).

5. Guo, Q. et al. Cell 172, 696–705 (2018).

6. Beck, M. & Baumeister, W. Trends Cell Biol. 26, 825–837 (2016).

7. Chang, Y.-J., Jeng, U.-S., Chiang, Y.-L., Hwang, I.-S. & Chen, Y.-R. J. Biol. Chem. 291, 4903–4911 (2016).

8. Bauerlein, F. J. B. et al. Cell 171, 179–187 (2017).

9. Wehmer, M. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 114, 1305–1310 (2017).