這項研究打破細胞-結構生物學邊界，看見“漸凍人”細胞內病變的結構基礎

低複雜度蛋白質聚集是神經退行性病變的重要標誌。現在，一份此種聚集的高分辨率結構快照史無前例地呈現在我們面前，揭示出這些蛋白質對重要細胞功能的破壞。

撰文 Laura Pontano Vaites & J. Wade Harper

翻譯寒雨

審校趙維傑郭強

神經退行性疾病常常與短核苷酸重複序列插入的基因突變有關。在肌萎縮性脊髓側索硬化症（ALS，亦稱運動神經元病、漸凍症）和額顳葉癡呆中，C9orf72 基因非編碼區的短重複序列插入 1,2會產生含有甘氨酸（G）和丙氨酸（A）殘基重複序列的異常翻譯產物。這些 poly-GA 產物在神經元中形成聚集。既有研究顯示，這些聚集會阻礙蛋白酶體複合物降解蛋白質這一關鍵細胞活動3,4。然而，對於這種破壞產生的生化基礎及其致病機制，我們仍然知之甚少。在這篇 Cell 文章中，郭強等人5利用 3D 冷凍電子斷層掃描技術（cryo-ET）精確地繪製了神經元中 poly-GA 聚集和相關大分子複合物的組織和結構特徵，將 poly-GA 對蛋白酶體的破壞直觀地展現出來。

3D cryo-ET 使用電子顯微鏡從不同角度對一個超薄、冷凍、含水的細胞切片進行觀察，並由此重構出三維立體圖像。作者利用 3D cryo-ET 實現了神經元的可視化，這些神經元經過遺傳改造，表達包含 175 個或 73 個拷貝的 poly-GA 片段。這些片段帶有綠色熒光蛋白標籤，可以被光學顯微鏡精確定位。在體內，C9orf72 擴增需要很長時間來形成 poly-GA 片段，而這些工程蛋白可以有效地對內源 poly-GA 片段進行模擬。作者發現，poly-GA 蛋白呈高度簇狀，由厚度相對均勻，但長度和寬度存在差異的紐帶結構組成並時常具有二叉狀分支結構，這一結果與先前常規電子顯微鏡的體外觀察結果相似 6。

這項工作不僅觀察了細胞中 poly-GA 聚集的詳細結構，而且將 poly-GA 結構與 poly- Q 結構進行了比較。Poly- Q 是另一種基因異常擴增形成的聚集，可導致另一種神經退行性疾病：亨廷頓病。2016 年，該研究組已經完成了對其結構的 3D cryo-ET 分析 7。這種比較揭示出的結構差異，可以幫助研究者對兩種聚集致病機制的差異進行解讀。

首先，兩種聚集本身的結構是不同的。poly- Q 形成纖維狀聚集，與 poly-GA 聚集相比，它很少分支，緻密程度也更低 7。

其次，當作者使用計算手段，在聚集中搜尋已知的大分子複合物時，他們發現許多蛋白酶體被募集到了 poly-GA 聚集中（圖 1）。而生化數據也表明，神經元中多達 50% 的蛋白酶體複合物都被募集於 poly-GA 紐帶結構中。將蛋白酶體通過這種隔離機制從其在細胞中的正常位置移除，或許可以解釋含有聚集的細胞中蛋白酶體活性的降低 4,8。核糖體是介導蛋白質合成的複合物，其大小與蛋白酶體相當，但極少存在於 polyGA 聚集物中，這表明蛋白酶體會主動招募 poly-GA 聚集或主動保持與 poly-GA 聚集的結合。poly- Q 纖維卻與之不同，它不含蛋白酶體，但與多種細胞器的膜結構緊密接觸，這種相互作用可以導致內質網等細胞器的膜結構發生形變。這種形變則可能影響蛋白質的翻譯、運輸和降解途徑7。

圖 1 聚集毒性產生機制的對比。a, 與一大類 ALS 相關的 poly-GA 在神經元中形成聚集。作者 5通過細胞內高分辨率結構，展示了與蛋白酶體（圖中爲藍色）結合的由 poly-GA 形成的帶狀聚集（圖中爲紅色）。蛋白酶體參與其他蛋白質的降解過程，它被 poly-GA 聚集捕獲並處於功能停滯狀態，從而導致細胞毒性。Poly-GA 聚集不與囊泡和內質網等具膜細胞器結合。b, 但與亨廷頓病相關的 poly- Q 聚集呈纖維狀（圖中爲紫色）7，這些聚集使囊泡膜和內質網膜產生形變。這些結果表明不同的聚集可以通過不同的機制引起神經退行性改變。

蛋白酶體由桶狀的核心亞基（蛋白質底物的切割降解在此發生）和一個或兩個調節亞基組成，這些調節亞基覆蓋在桶的末端，形成其蓋子，對試圖進入蛋白酶體內部的分子進行限制，保證只有攜帶泛素標記的蛋白才能進入。在既有研究中，研究者曾觀察到調節顆粒的多種構象 9,10，表明蛋白酶體會在基態、準備態和底物結合態之間發生循環性的構象變化。作者使用計算方法對蛋白酶體圖像進行平均，從而判斷圖像中蛋白酶體的狀態（相關技術參考文獻 11）11，發現在 poly-GA 聚集內同時存在基態和底物結合態的蛋白酶體。他們還發現，與不含 poly-GA 產物的對照組神經元相比，表達 poly-GA 的神經元中具有兩個調節亞基的蛋白酶體的比例大幅增加。聚集中接近四分之一的蛋白酶體都與一種近期解析的蛋白酶體構象9一致，在這種構象下，蛋白酶體與底物結合，但底物被困於蛋白酶體核心亞基中，使蛋白酶體的功能處於阻滯狀態。而在那些與 poly-GA 紐帶最爲接近的蛋白酶體中，處於阻滯狀態的蛋白酶體比例更高，達到 36%。

爲什麼會發生這種阻滯？在重建的斷層圖像中，作者在 poly-GA 紐帶和蛋白質 RAD23 與蛋白酶體的結合位點之間發現了許多有電子密度分佈的區域。 RAD23 參與將泛素標記的蛋白底物募集到蛋白酶體的過程，並且會在 poly-GA 聚集中富集 8。由此推斷，這些電子密度可能代表着與聚集內 RAD23 結合的泛素化標記的蛋白底物。研究者尚不清楚“噎住”蛋白酶體的究竟是哪些蛋白，但 poly-GA 片段本身很可能就是其中之一，並通過這種途徑直接導致了蛋白酶體活性的降低。不管具體機制如何，細胞內蛋白酶體活性的降低都會對蛋白質降解途徑有害，並由此導致細胞毒性。

這些結果又引出了幾個需要回答的重要問題。

首先，由 C9orf72 擴增誘發的 ALS 被認爲與 poly-GA 聚集形成以及 C9orf72 蛋白產物的減少都有關係，但這兩種機制所造成的影響各有多大？C9orf72 蛋白參與形成細胞自噬相關的複合物 12。細胞自噬是細胞內蛋白質等組分被降解和循環利用的過程。因此，C9orf72 蛋白水平的降低可能與 poly-GA 依賴的蛋白酶體抑制共同增加了神經元毒性。

其次，poly-GA 聚集對其他蛋白質的捕獲是否也會增加細胞毒性？在 poly-GA 聚集中富集的自噬相關蛋白 p62 就是進一步的研究對象之一 8。

第三，與聚集解聚相關的幾種分子機器都沒有在 poly-GA 結構中富集，其原因尚不清楚。

最後，poly-GA 是由 C9orf72 擴增產生的表達量最高的重複序列蛋白，但不是唯一一種——突變也可以產生甘氨酸 - 精氨酸（poly-GR）和脯氨酸 - 精氨酸（poly-PR）聚集。這些其他聚集的結構與 poly-GA 相比如何？大多數關於 poly-GR 和 poly-PR 聚集的既有數據認爲它們不會纏結蛋白酶體，這意味着它們通過其他機制產生毒性 13,14。

進一步的 3D cryo-ET 研究，以及對於 C9orf72 插入突變序列的天然翻譯產物，而非本研究中使用的構建蛋白產物進行深入分析，可能會澄清患者體內聚集與研究中使用的模型聚集之間的異同。

概括而言，此項工作以前所未有的分辨率，使用 3D cryo-ET 實現了對細胞內基本進程的可視化觀測 11。此外，它爲理解聚集相關神經退行性疾病的複雜機制奠定了新的基礎。

參考資料

1. DeJesus-Hernandez, M. et al. Neuron 72, 245–256 (2011).

2. Taylor, J. P., Brown, R. H. Jr & Cleveland, D. W. Nature 539, 197–206 (2016).

3. Yamakawa, M. et al. Hum. Mol. Genet. 24, 1630–1645 (2015).

4. Zhang, Y.-J. et al. Acta Neuropathol. 128, 505–524 (2014).

5. Guo, Q. et al. Cell 172, 696–705 (2018).

6. Beck, M. & Baumeister, W. Trends Cell Biol. 26, 825–837 (2016).

7. Chang, Y.-J., Jeng, U.-S., Chiang, Y.-L., Hwang, I.-S. & Chen, Y.-R. J. Biol. Chem. 291, 4903–4911 (2016).

8. Bauerlein, F. J. B. et al. Cell 171, 179–187 (2017).

9. Wehmer, M. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 114, 1305–1310 (2017).