北京大學陳良怡團隊聯合華中科技大學譚山團隊發明了一種超靈敏結構光超高分辨率顯微鏡--海森結構光顯微鏡（Hessian SIM）。此項成果近日以全文形式在線發表於Nature Biotechnology（影響因子41.67），論文題目爲“Fast，long-term，super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy”。

▲圖1：海森結構光顯微鏡解析囊泡融合孔道形成全過程。上圖：實際的動態過程解析；下圖：由實驗結果得到的囊泡融合的四個中間態。

在每秒鐘得到188張超高分辨率圖像時，海森結構光顯微鏡的空間分辨率可以達到85納米，能夠分辨單根頭髮的1/600到1/800大小結構，而所需要的光照度小於常用的共聚焦顯微鏡光照度三個數量級。由於極低的光漂白以及光毒性，實現了100 Hz超高分辨率成像下連續採樣10分鐘得到18萬張超高分辨率圖像，或者是在1 Hz超高分辨率成像下連續1小時超高分辨率成像基本無光漂白。

與獲得2014年Nobel化學獎的受激輻射損耗超高分辨率顯微鏡（STED）相比，海森結構光顯微成像以極高的時間分辨率、極低的光毒性在活細胞超高分辨率成像方面佔顯著優勢。例如，在觀察細胞內囊泡與細胞質膜融合釋放神經遞質和激素過程中，海森結構光顯微鏡與STED顯微鏡（分辨率60納米，每秒5幅左右；巫凌鋼實驗室2018年3月Cell上線的文章）都可以觀察到囊泡融合形成的孔道；但是，海森結構光顯微鏡還解析出囊泡融合時四個不同中間態，包括囊泡打開3納米小孔、囊泡塌陷、融合孔道維持和最後的囊泡與細胞質膜完全融合的過程，真正可視化膜孔道形成的全過程（圖1）。

▲圖2、海森結構光顯微鏡顯微鏡下觀察到COS-7細胞中的內質網和線粒體相互作用的動態過程，藍色的線粒體用MitoTracker Green標記，可以清楚辨識內嵴結構；品紅色的是用SEC61-mCherry標記內質網結構。

此項突破一方面是基於硬件自主設計的新偏振旋轉玻片陣列、高精度的時序控制程序以及高數值孔徑物鏡的應用；另一方面是創新的重構算法，借鑑了人眼區分信號和噪聲的機制，首次提出將生物樣本在多維時空上連續、而噪聲是完全隨機分佈的先驗知識用於構建海森矩陣，指導超高分辨率熒光圖像的重建。

超靈敏海森結構光顯微鏡是目前活細胞成像時間最長、時間分辨率最高的超高分辨率顯微鏡，適用於各種細胞、不同探針的熒光成像–可以說，所有應用掃描共聚焦顯微鏡的場景都可以使用海森結構光顯微鏡，因而具有廣泛的應用前景。

該論文的第一作者爲北京大學黃小帥、華中科技大學範駿超和北京大學李柳菊，通訊作者爲北京大學陳良怡、華中科技大學譚山。工作得到了國家自然科學基金委重大儀器研製基金、重大研究計劃專項、科技部國家重點研發計劃基金、重點基礎研究發展計劃和北京市自然科學基金委重點項目的資助。陳良怡、黃小帥等主創成員參與了早先發表於Nature Methods的高分辨率微型化雙光子顯微鏡的研製，榮獲2017年中國十大科學進展等榮譽。未來，他們將進一步實現微型化海森結構光的顯微在體成像。