猪是大肠杆菌的易感群体，大肠杆菌常引起仔猪黄痢、仔猪白痢和断奶仔猪水肿病，通常情况下大肠杆菌病的发病率和死亡率均较高，是一类重要的人畜共患病。随着我国养猪规模的不断发展，该病的发病率及死亡率也逐年提高，并且逐渐由条件性疾病演变为常发性疾病，严重阻碍了养猪业的健康、快速发展。此外，由于抗生素的大量使用，大肠杆菌的耐药谱和耐药水平不断提高，大肠杆菌的耐药性越来越严重。针对这种情况，笔者进行了猪源性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验研究，以期解决贵州某猪场在治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的药物选择问题，避免盲目使用或滥用抗生素类药物而产生耐药性。 猪病临床表征见图1和图2。

图1 15 日龄仔猪临床表现

图2 2月龄发病仔猪表现

1、病料

病料为贵州省福泉市某猪场病死仔猪的肝脏、肺脏、直肠棉拭纸等。病猪剖检情况见图3。

图 3 发病仔猪剖检情况

2、方法

▌ 2.1 细菌的分离与纯化

无菌采集病料，接种于普通LB琼脂培养基、SS琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基进行培养。

▌2.2 细菌的革兰氏染色

在一干净的载玻片上滴加10 µL三蒸水，用接种环挑取已纯化培养的单个菌落，与载玻片上的三蒸水充分混匀，用酒精灯进行火焰固定或自然风干，然后进行革兰氏染色，待染色区域风干后，于油镜下观察细菌的染色情况和形态。

▌2.3 细菌的生化试验

挑取纯培养的菌落接种于细菌微量生化鉴定管进行鉴定。

▌2.4 分离菌株16S rRNA基因扩增

以分离菌株的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增，预扩增片段为1 492 bp。PCR反应结束后，取PCR产物5 µL，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段胶回收后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，对测序结果进行核苷酸同源性的比较及系统进化树的构建。

▌2.5 分离菌株的药敏试验

挑取LB琼脂培养基上的单个菌落于LB液体培养基中增菌培养，约12 h后取0.5 mL菌液均匀涂布于LB琼脂培养基表面，待菌液吸收后贴上庆大霉素、青霉素、链霉素、氨苄西林、环丙沙星、多西环素、阿莫西林、卡那霉素、磺胺甲基异噁唑、头孢曲松、氧氟沙星等11种药敏纸片，置37 ℃培养箱中培养12～16 h，观察结果，并用直尺测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径大小判定细菌对药物的敏感性。

3、结果与分析

▌3.1 分离菌株的菌落形态观察

分离菌株在LB琼脂培养基上形成圆形、凸起、光滑、灰白色、半透明的菌落，直径为2～3 mm，见图4A；在伊红美蓝琼脂培养基上形成圆形、表面光滑、稍凸起、边缘整齐、紫黑色并带金属光泽的菌落，见图4B；在SS琼脂培养基上形成圆形、光滑、稍凸起、边缘整齐、粉红色的菌落，见图4C；分离菌株菌落经革兰氏染色为红色、两端钝圆的直杆状，大小为2～5 µm，见图4D。3种培养基上的菌落形态及革兰氏染色结果与大肠杆菌的基本特性相符。

图4 分离菌株的形态学观察结果（10×100）

▌3.2 分离菌株的生化鉴定

分离菌株能发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖和甘露糖，尿素酶、山梨醇、赖氨酸脱梭酶、吲哚试验、甲基红试验结果均为阳性，V-P试验、卫矛醇试验、KCN试验、H2S试验及枸橼酸盐试验结果均为阴性，以上生化鉴定结果参考《伯杰氏细菌鉴定手册》上的判断标准，与大肠杆菌的生化特性基本相符。

▌3.3 分离菌株的16S rRNA基因鉴定

用细菌16S rRNA基因的通用引物扩增目的序列，扩增的片段大小与预期目的片段1 492 bp接近。将分离菌株的目的片段胶回收后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，结果表明：分离菌株与NCBI上的大肠杆菌菌株的同源性为99.5%～99.9 %；且与大肠杆菌菌株84（登录号为MF399285.1）在同一遗传进化分支上，与未鉴定的菌株E6aB04（登录号为DQ103622）亲缘关系较远。

▌3.4 药敏试验

分离菌株对卡那霉素、环丙沙星、氧氟沙星高敏，对头孢曲松中敏，对阿莫西林、氨苄西林、链霉素、磺胺甲基异噁唑、多西环素、庆大霉素、青霉素等不敏感。

4、讨论

大肠杆菌血清型很多，且具有较强的地域性分布，弄清各地致病性大肠杆菌的优势血清型及敏感药物，对于该病的区域性防治具有重要的指导意义。在临床实践中可以根据药敏试验结果挑选有效抗生素，并注意交叉用药，用量适当，尽可能控制和减少耐药性的产生，提高抗生素对猪大肠杆菌病的防治效果。

刘米山从江苏省泰州地区16个猪场采集40头腹泻仔猪的病料中分离出38株大肠杆菌，药物敏感性试验结果表明，26株致病菌对16种抗菌药物的敏感性各异，其中90%以上的菌株对头孢噻呋高度敏感，可以作为临床用药的首选参考。焦凤超等从河南省罗山县某猪场腹泻仔猪肝脏分离到1株大肠杆菌，药敏试验结果显示，分离菌株对头孢曲松、头孢噻呋、头孢噻肟和丁胺卡那等药物高度敏感，对四环素、强力霉素、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星等药物产生耐药性。

本试验从贵州省福泉市某猪场分离菌株与NCBI上的大肠杆菌菌株的同源性为99.5%～99.9%，且与大肠杆菌菌株84（登录号为MF399285.1）在同一遗传进化分支上，与其他未鉴定的菌株E6aB04（登录号为DQ103622）亲缘关系较远。该菌株对卡那霉素、环丙沙星和氧氟沙星高度敏感，对头孢曲松中度敏感，对阿莫西林、氨苄西林、链霉素、磺胺甲基异噁唑、多西环素、庆大霉素、青霉素等敏感度低或不敏感，由于该猪场用过泰乐菌素、氟苯尼考、氨苄西林、阿莫西林等抗生素，故对氨苄西林、阿莫西林等抗生素产生了耐药性。

作者 | 石远菊 汤德元* 曾智勇 王 彬 黄 涛

胡玲玲 龙冬梅 杨 伟 叶 丽 郭倩妤 廖少山

贵州大学 动物科学学院