撰文丨小白薯

责编丨迦溆

图片引自：https://electron.nci.nih.gov

近日，程亦凡博士受邀在Science杂志发表题为Single-particle cryo-EM—How did it get here and where will it go特别综述，讲述单颗粒冷冻电镜（Cryo-EM）的前世今生，以及它未来将走向何处！程亦凡博士在该篇综述中探讨了过去40多年来电镜发展的迷人故事，深入研究了近期的技术进步是如何以及为何如此具有开创性，最后并简要介绍了该技术未来的发展方向。

前言 ▲▲▲

物理学家和诺贝尔奖获得者Richard Feynman曾说，“你只要看到它，你就能回答许多基本的生物学问题！”我们中国人也讲究“眼见为实”！确实如此，在生物学领域，一旦我们能够以原子分辨率详细地“观察”到目标蛋白或分子，我们自然能够回答复杂生物过程的组成部分和参与者是如何以及为什么以他们的方式工作的。正是为了实现这一目标，结构生物学在整个历史中为许多重大生物学问题作出了不可磨灭的贡献。

结构生物学就是利用生物物理化学等研究方法，在原子水平上解析生物大分子的三维结构及其动态变化，进而解释生物大分子的生物学功能及其工作机制。结构生物学起源于英国剑桥 MRC 分子生物学实验室—第一个蛋白质结构血红蛋白和DNA双螺旋结构的解析均来自MRC，并且都获得了诺贝尔奖—标志着生命科学的研究从那以后进入了分子生物学时代。以后，它还将并将继续促进生物学的发展，为针对众多疑难杂症的药物开发，以治愈疾病或改善病理症状发挥它应有的作用。

结构生物学家三大手段包括X射线晶体学，核磁共振（NMR）和电子显微镜（EM）。其中，X射线晶体学贡献了蛋白质数据库（PDB）中约90%的生物大分子结构。在该方法中，解析结构由生物大分子良好的三维晶体产生的衍射图案确定。结构的分辨率很大程度上取决于晶体的质量；简而言之，获得足够大小的三维晶体通常是该技术解析生物大分子原子结构的先决条件。它适用于许多蛋白质或稳定的复合物；然而，对于某些类别的生物大分子，生长大而有序的晶体是一项非常困难或不可能完成的任务。例如，完整的膜蛋白结晶，大而动态的复合物机器，对晶体来说都非常具有挑战性。X射线晶体学的拓展是X射线自由电子激光（x-ray free electron laser，XFEL），XFEL的最终目标是确定没有晶体的原子结构，但目前仍然需要大量的小晶体才能实现，因此也具有一定的局限性。

可以在没有结晶的情况下确定生物大分子的原子结构吗？虽然NMR技术可以在溶液状态先直接解析蛋白质的分子结构，但是其主要的目标分子的分子量通常需要小于50 kd，对于大的蛋白的处理非常困难；另外，NMR技术对于蛋白的浓度和稳定性要求非常高，对于很多表达量很低/稳定性不高的蛋白分子处理较困难，因此潜力有限。

冷冻电镜的崛起 ▲▲▲

或者正如Feynman曾提出的那样，是否有可能通过使用强大的电子显微镜“观察”它们来确定它们的结构？早期的先驱者在20世纪70年代就开始攻克这个问题并开发了一种基于EM的方法，即如今单粒子冷冻电镜（cryo-EM）【1，2】。冷冻电镜解析结构的方法是先将生物大分子样品冷冻固定在玻璃态的冰中，然后再通过用电子显微镜对生物大分子进行成像，再应用计算机软件对所摄取的生物大分子图像进行图像处理和计算，从而重构出生物大分子的三维结构。

最初，该方法产生了相当低分辨率的结果。然而，为了能够直接研究生物大分子而不需要结晶生物大分子，很多科学家在这四十多年内完善了该技术，从而在技术的适用性和结果的分辨率方面得到稳定的改进。逐渐地，随着近些年来Cryo-EM对生物大分子结构的解析的井喷式发展，它已成为结构生物学的主要工具，与X射线晶体学相辅相成，广泛用于研究难以结晶的大分子复合物。

今天，单粒子冷冻电镜已经不再是结构生物学领域的一种互补技术，而是逐渐成为了一种主导技术，以深刻和前所未有的方式改变结构生物学领域，促进并引领着重大新发现。我们都知道，2017年诺贝尔化学奖授予了三位杰出的生物物理学家，Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson，以表彰他们在Cryo-EM中的推动性贡献（王宏伟评论丨2017年诺贝尔化学奖评述——冷冻电镜技术获奖并不意味着该技术已经成熟）。Dubochet主要贡献是系统性研究低温制样技术的贡献，Frank主要是软件图像处理方面，Henderson主要是在理论上的指导和单颗粒冷冻电镜的发展的贡献。当然，在冷冻电镜的开发、应用，以及推广到被广泛接受的过程中，除了这三位大咖，还有其他的很多人在其中做出了不可磨灭的贡献，比如说Robert M. Glaeser教授、程亦凡博士、Sjors Scheres博士等在技术的开发，国内的施一公、颜宁、柳振峰等老师在技术的应用推广上等。

目前的Cryo-EM主要分为了三个不同但密切相关的方向：电子晶体学（electron crystallography），单粒子冷冻电镜（single-particle cryo-EM）和电子低温断层扫描（electron cryotomography，Cryo-ET）。在过去几年中，单粒子Cryo-EM引发了结构生物学的革命，并已成为一个新的主导学科。

单颗粒冷冻电镜简史 ▲▲▲

实际上，要想直接在电子显微镜中“观察”到生物大分子是很难的，而从电子显微镜照片去确定其原子结构则更复杂。冷冻电镜技术由低温制样、低剂量电镜成像和计算机图像处理三部分组成。其中的每一步在开发之初都遇到了很大的困难。这其中，有非常多的科学家投身其中，把问题一个一个解决掉。主要可能有以下几个方面：

首先，EM图像是生物大分子的2D投影，但不是它们的3D结构。为了解决这个问题，Klug和De Rosier在上世纪60年代就建立了冷冻电镜三维结构解析的理论基础，该原理基于数学中的傅立叶变换（Fourier transform，FT）相关的中央截面定理和傅立叶变换的性质。Klug因为证明了可以通过沿不同方向组合同一物体的2D投影图像来重建3D结构【3】，获得了1982年诺贝尔化学奖。

其次，由于强散射，电子束必须被限制在高真空中，并且所有EM样品都需要放置在该真空中。这对于无机材料来说不是问题。但如果只是将生物样品放入电子显微镜内，真空引起的脱水会严重破坏样品的完整性。1974年，美国UC Berkeley的Glaeser和Taylor完成了保持蛋白质样品在高真空中水合的看似不可能完成的任务。他们从冷冻水合过氧化氢酶晶体中记录出3 Å分辨率的电子衍射，证明了电镜可以解析到原子分辨率结构，并且，高真空中生物大分子的结构完整性可以通过快速冷冻来维持（图1A）【4】。1975年，Richard Henderson和Unwin也建立了使用电镜解析二维晶体结构的方法。但是由于很多生物大分子的二维晶体很难获得，该方法也未能广泛推广【5】。直到1984年，欧洲分子生物学实验室EMBL的 Dubochet及其同事开发了一种快速冷冻技术【6，7】。他们将纯化的蛋白质样品在溶液中应用到覆盖有薄薄的碳多孔薄膜的EM网格上，并用滤纸吸去网格，滤纸除去大部分溶液，并且表面张力将剩余的溶液驱动成穿过孔的薄液膜在碳膜中。将网格快速插入由液氮冷却的液态乙烷中，将其冷冻成薄层无定形冰，蛋白质样品以随机方向嵌入其中。之后，将冷冻的网格转移到电子显微镜中并保持在接近液氮的温度下进行成像（图1B）。Dubochet的这种方法可以使如此冷冻的生物大分子保持完整的结构信息，他的开创性工作也直接导致了今天广泛应用的单颗粒冷冻电镜技术的诞生。直到现在，除了使用机器来提高一些工作效率外，这种方法仍然没有什么大的改变。

第三，高能电子束的辐射损伤限制了生物样品成像的可能。若用低电子剂量记录的图像则会有非常差的信噪比（SNR）。将样品冷却至液氮或液氦温度可以减少辐射损伤并使样品能够承受更高的电子剂量【8】，但仍然无法直接显示原始显微照片中的高分辨率细节。Henderson和Unwin于1975年建立的电子晶体学方法克服了这个问题—对2D晶体的许多相同蛋白质的图像进行平均。在非常低的电子剂量下，对2D晶体的电子衍射产生了良好的衍射图案。再通过傅立叶变换计算，产生了样本的高分辨率投影图。组合不同角度样本数据产生类似于X射线晶体结构的密度图进行三维重建5。这种方法产生了第一个完整膜蛋白结构，最初的分辨率约为7 Å（图1C）【9】，最后是原子分辨率【10】。使用电子晶体学解析了几种完整膜蛋白和一种可溶性蛋白的原子结构，最高分辨率达到了1.9 Å—水通道蛋白（AQP0）【11】。但是，生长良好有序的2D晶体的困难阻碍了该方法的广泛应用。

与此同时，Frank提出了一种在没有结晶的情况下确定蛋白质结构的想法：计算相同类型的许多单个蛋白质颗粒的图像，再进行结构重建【1】。如何从冷冻在一层薄冰中的生物大分子电镜图像中提取结构信息，Frank在其中做出了巨大的贡献。1978年，Frank及其同事带着想法首先通过使用对蛋白质样品进行EM负染观察（图1D）【12】。这种方法与快速冷冻样品制备的后期组合成为我们现在称之为“单粒子Cryo-EM”，它不需要将蛋白质生长成任何形式的晶体。它通过软件计算在玻璃冰薄层内随机定向的生物分子图像来确定结构。上世纪80年代，Frank就提出了生物大分子单颗粒图像分类的多元统计分析方法，对提取结构信息的图像处理和三维结构计算方法集成到第一个三维重构软件包 SPIDER，为科研人员免费使用。

图1. 单颗粒冷冻电镜的建立

理论和实践都在一步一步往前推进着电镜技术的发展。除了制样、成像和图像处理三个问题解决外，对生物大分子的结构解析的最终目的使原子分辨率达到原子水平。2004年，Richard Henderson 对冷冻电镜单颗粒技术做了理论分析，指出冷冻电镜单颗粒技术理论上完全可以将结构解析到原子分辨率，并指出了技术上需要克服的关键问题：第一是提高冷冻电镜图像的信噪比；第二是克服冷冻电镜图像在摄像时的漂移13。Henderson的理论指导为冷冻电镜的发展指明了方向。

转型技术的突破—直接电子检测相机 ▲▲▲

一般来说，普通电子显微镜照片主要有三种方式：荧光屏、感光胶片和CCD相机。荧光屏可以实时显示电子图像，可用于实验中肉眼观测，但是无法长久保存，所以一般也不用于记录。胶片就与以前的老式照相机底片一样，能很好地记录保存图像。将样品成像记录在胶片上，随后在暗室中数字化处理并进行计算。对于单粒子冷冻电镜，优质的胶片性能足以使生物样品在亚纳米分辨率下进行三维重建，解析出α-螺旋等二级结构轮廓，但很难构建原子模型【14】。另外，由于电镜装载底片的容量有限，使用胶片的方式需要经常卸换底片，而此过程可能造成污染，并干扰镜筒的真空度。再者，由于摄影胶片在保持低频信号方面比较差，因此难以进一步提高分辨率。虽然有科学家用此方法曾将大型病毒分辨率解析到接近原子水平【15】，但整个过程缓慢而乏味，限制了结构解析的通量和普适性。

在20世纪90年代后期，引入电荷耦合器件（charge-coupled device，CCD）相机以数字方式记录电镜照片。CCD相机不能直接检测电子，需要荧光闪烁体将入射电子信号转换成光子信号，然后再把光信号传送到图像感应器，再转换为数字图像。在这种转换过程中，有很多因素限制着分辨率的提高。例如，从成像电子入射到最后被读出，会经历闪烁器电子和光子的散射，还可能受到透镜耦合度的影响，这些事件则可能将单个电子撞击传感器的点事件模糊成更大尺寸的光子团，降低信噪比 【16】。此外，冷冻电镜为了降低电子辐射损伤，须用低剂量电子摄取图像，CCD 摄像需用较长时间（一般1秒）。时间过程，则容易由于样品漂移导致图像模糊而降低分辨率。CCD相机也不适用于常规的高分辨率结构测定（图2A），此前大部分的高分辨率病毒结构的电镜数据都是用感光胶片进行收集的。不过，总的来说，将CCD相机引入cryo-EM的影响仍然很重要，因为它可以实现长时间连续自动化高通量的图像采集【17】。

将单粒子cryo-EM从低分辨率提升到原子结构测定的突破技术是直接电子检测相机（electron direct detection device，DDD）的引入【18】。2013年，程亦凡博士与David Agard（曾是Henderson 实验室的博士后）把DDD用于冷冻电镜单颗粒电镜图像记录【19】。DDD直接记录电子信号，无需进行电子-光学信号转换，保持了原始信号的强度，降低了点扩散效应。同时，冷冻电镜图像能够被记录为一堆电影帧，每个电影帧都在短时间内被记录【20】。由于速度快，也能减少了样品漂移产生的图像模糊，提高电镜图像的分辨率。用DDD相机记录的图像可以保持高频信号确定高分辨率结构，保持低频信号用于图像对准所需的对比度（图2，B和C）。因此，用DDD纪录的图像分辨率高、信噪比高、信号强、读出速度快，解决了一直限制cryo-EM发展中的两个最困难的问题，使得许多生物大分子复合物可以以原子分辨率重建3D密度图。

图2. 直接电子检测相机促使原子结构的解析

新的图像处理算法 ▲▲▲

重建的分辨率还取决于样品的构象均一性和用于重建密度图的所有颗粒的图像比对的准确性。因此，在电镜图像处理中，对分子图像进行分类并确定其空间取向是其中最关键的步骤。因为每个单颗粒图像的信噪比很差，所以不能将单个粒子分类并且确定地分配到特定的类别中去。早期的电镜图像处理软件主要通过分子的电镜图像与模型的不同方向投影进行相关性比较，以相关性最大的方向来确定分子取向，通过主成分分析来确定分类。在20世纪90年代后期，图像处理使用基于最大似然概率的方法【21】。

2012年，英国 MRC-LMB 的Sjors Scheres及其同事将贝叶斯方法引入冷冻电镜三位重建【22】，并在RELION软件中实现【23】。这个程序很快在单粒子冷冻电镜图像处理中变得非常受欢迎。这种方法比传统的确定性方法更强大，特别是对更大、更复杂的数据集图像进行分类时。它不仅可以最大程度上将不同的分子构象分开，大大提高了同一构象分子取向的确定性，还可以使得生物大分子的分辨率提高。RELION的图像处理方法对不同分子构象的识别，使得在电镜层面实现动态分子过程重构成为可能。只要分子的数量足够多（数十万甚至上百万），对其假想的中间状态进行分类处理，再能结合功能信息，确定这些不同构像在行使功能过程中的时间顺序，理论上就可以同时重构出生物大分子动态变化的整个过程，从而从原子水平阐明其工作机制。剪接体的过程重构或许就是一个最好的实例之一。

RELION的图像处理方法，使“静态的结构生物学”发生了向“动态的结构生物学”的转变。这一图像处理和三维重构算法的突破很大程度上推动了冷冻电镜的革命，这一成果被Nature杂志评为 2014年度 “十大科学进展”之一。巧合的是，RELION的开发大致发生在DDD在冷冻电镜中被广泛使用的同时。它们共同提供了20多年前理论预测的单粒子Cryo-EM的全部潜力,给世界带来了革新。

电镜的自动化 ▲▲▲

从技术上讲，单粒子Cryo-EM是一种相当复杂和繁琐的技术。每次重建都需要大量高质量的EM图像。这些图像主要由经验丰富的个人操作，对用户的技术要求很高，因为他们不仅需要很好地理解电子光学系统，还需要很好地理解与Cryo-EM数据采集相关的许多基本技术问题。他们还需要非常地耐心，坐在显微镜前几个小时，重复相同的程序，以收集大量的EM照片。所需的专业知识水平使得单颗粒冷冻电镜无法更广泛的进入结构生物学界。幸运的是，早期就认识到这个问题的Carragher和Potter博士开发了高质量自动化数据方法【17】。电镜本身也发展成为更适合自动数据采集的设备。现在，许多Cryo-EM设施的运行方式类似于X射线同步加速器光束线站—由一些训练有素的科学家支持。在这些设施中，经过最少培训的普通用户也可以使用自动程序获得高质量的EM数据，甚至可以远程获取。

结构生物学的新纪元 ▲▲▲

由于单颗粒冷冻电镜的这些技术突破，结构生物学进入了一个新的时代。现在可以解析许多结晶困难的目标结构。这样的例子如今已不胜枚举。从最初的程亦凡课题组的瞬态受体电位（TRP）离子通道，到施一公老师在短短几年确定的剪接体全过程的不同状态；从Frank利用电镜技术解析的核糖体结构，到颜宁课题组的钠钾钙离子通道（Science丨颜宁组解析人源电压门控钠离子通道蛋白Nav1.4-β1复合物结构；Science | 颜宁等揭示动物毒素调控Nav通道的详细结构机制——廖军点评；颜宁组Cell报道电鳗NaV1.4-β1复合体近原子分辨率结构丨BioArt特别推荐），等等。以TRP通道超家族蛋白为例，它包含七个亚家族，人类共有27个成员【24】。每个渠道都扮演着不同的生理角色;其中一些是治疗各种人类疾病的药物靶点【25】。除了小部分外，尝试结晶TRP通道超家族的任何成员都失败了【26】。随着结晶路障被去除，整合膜蛋白的原子结构现在正在快速确定。在不到5年的时间里，现在已经确定了七个TRP通道亚家族中每一个的至少一个成员的原子结构（图3）。

图3. 单粒子cryo-EM能够确定TRP通道的原子结构。

冷冻电镜的广泛应用使得结构生物学的快速发展是前所未有的。它也吸引了很多大型制药公司，许多公司希望将cryo-EM应用于基于结构的药物发现和优化。

未来展望 ▲▲▲

随着许多新技术的开发，单粒子低温-EM继续快速发展。也还有很多方面还可以继续提升。主要集中在以下几个方面。一、继续优化图像的对比度，或者在其他方面取得突破，使得Cryo-EM更加广泛的用于研究非常小的蛋白质【27】，以及具有不规则形状的更动态的复合物或组件。第二、开发一种新的样品制备技术，减少微升到纳升所需的样品总量。第三、使更容易达到接近2 Å及以上的分辨率，提高稳健性和通量。一旦可以可靠地实现非常高的分辨率，制药公司将能够很容易的使用EM来加速基于结构的药物发现。

如果继续推动这项技术的发展，那么单粒子冷冻电镜还可以提供超越结构测定的进一步生物发现。如前面所说，理论上，图像分类可以将包含不同构象或组成的EM数据集分为多个类，每个类对应于不同的功能状态。通过在特定时间点冻结低温EM网格，可以以时间依赖的方式得出结构信息【28】。因此，可以在完整的原子细节中逐步理解和分解生物大分子复合物的复杂循环过程。将来，也可以通过直接从细胞原位研究生理和病理中的生物大分子状态，即电子低温断层扫描（Cryo-ET）技术，将结构生物学引入“原位结构生物学时代”。

在过去的40年中，单粒子低温电镜技术的发展不仅吸引了众多的用户，还吸引了来自不同领域的人才：从物理学，材料科学到数学再到机器学习。这种新想法和众多科学家的参与预示着单颗粒冷冻电镜有更加光明的未来—一路上充满了方法开发与协作，最重要的是，美妙的生物的新发现！

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