科學家開發新策略衡量記憶T細胞反應
免疫記憶是適應性免疫應答的重要特徵，也是通過接種疫苗產生免疫保護的基礎。
適應性免疫的主要參與者包括：負責呈遞抗原併產生抗體的B細胞，直接殺傷受感染細胞或腫瘤細胞的殺傷性CD8+T淋巴細胞，負責調節CD8+ T細胞和B細胞功能的CD4 +輔助T細胞。
爲了檢測人體從感染中恢復後是否產生免疫保護，或者在接種疫苗後是否產生免疫保護，研究人員通常需要衡量相應抗原的記憶B細胞或記憶T細胞亞羣比例來判斷。
其中抗體效價是特異性抗體生物活性的重要標誌，反應了特異性抗體與抗原的結合能力，是疾病診斷和疫苗評價等領域的重要指標，對其進行檢測在臨牀上意義重大。
抗原特異性T細胞，由於其細胞亞羣效應功能的複雜性，以及幾乎無限的抗原種類，無法進行全面系統的研究。
這不僅阻礙了T細胞在疾病診斷和臨牀上的應用，也阻礙了針對結核病、艾滋病，瘧疾和腫瘤等的疫苗開發。
因此，科研人員對於探討病原體或腫瘤的抗原特異性T細胞應答的的興趣日益增長，尤其是尋找更加靈敏和特異性的分析方法。
1996年，John D.Altman和Mark M. Davis開發的“四聚體”成爲闡明體外抗原特異性T細胞的關鍵工具，對該領域的進步作出了重大貢獻（1）。
值得注意的是，組合標記和DNA條碼方案的使用，允許一次測試數百到數千個四聚體（2-6），使得檢測的通量大幅度提高。
除了ICS和四聚體外，通過細胞因子的細胞表面捕獲和抗原刺激後使用活化標記都可以用來鑑定抗原特異性T細胞。
據WHO估算，2017年全球的結核病潛伏感染人羣約爲17億，潛伏感染率爲23%。
全球新發結核病患者約1000萬，結核病發病率爲133/10萬。有效的疫苗是有效預防肺結核的關鍵。
目前很多的證據表明T細胞在肺結核的免疫保護中起重要作用，但是一直缺乏有效的方法來最廣泛的捕獲結核分枝桿菌（Mtb）特異性T細胞庫。
這裏面有多層次原因。
首先，Mtb基因組高達4.4 Mb，包括3000多個基因，因此，無法利用合成肽段的策略作爲抗原來覆蓋整個蛋白質組。
其次，四聚體的研究策略常常需要一個具有代表性的HLA等位基因。由於大部分病人樣品的HLA等位基因變化紛雜，以至於很難找到一個主要的代表來構建四聚體。
第三，不同的T細胞亞型可能參與了針對Mtb的保護，通過對單一的細胞因子或單一的參數進行檢測就不夠全面。
爲了克服這些問題，美國斯坦福大學醫學院的研究人員開發了一個新的策略研究抗原特異的T細胞，既可以廣泛分析感染者中CD4+T細胞對Mtb的反應，又可以鑑定這些CD4+T細胞抗原。
相關論文2020年4月27日發表於《自然—生物技術》。黃璜博士和王春林博士爲共同第一作者，通訊作者爲Mark M.Davis教授。
該方法的第一部分是大規模的蒐集Mtb特異的T細胞及其T細胞受體（TCR）。
用整個Mtb裂解物刺激PBMC，使用T細胞活化標記物CD154從PBMC中鑑定Mtb特異性T細胞，然後進行單細胞分析。
原則上，細菌裂解物涵蓋了細菌中最廣泛的抗原譜。
爲了更好地分析已鑑定出來的大量TCR序列，作者先前開發了一種算法GLIPH，該算法可以根據序列相似性對相同特異性的TCR序列進行聚類，並根據受試者的基因型預測這些TCR聚類的HLA限制，從而幫助探尋新的抗原（7）。
在新研究中，作者們開發了一個更新版本，即GLIPH2，它可以以更高的速度、準確性和效率分析多達數百萬個TCR序列。
通常，通過計算每個個體的TCR重複數來進行克隆擴增分析，人們專注於單個個體的T細胞克隆擴增變化。
與此互補的是，GLIPH2分析使我們能夠從整個羣體的角度關注個體之間共享的特異性，這將極大的推動疫苗候選抗原的發現。
該方法的第二部分是通過篩選Mtb的整個基因組，來尋找新的CD4+ T細胞抗原。
通過第一步的GLIPH分析，作者們確定出了上百個TCR類羣。
爲了確定它們的抗原，研發了一套高效的T細胞報告系統，一方面通過在細胞系J76中表達感興趣的TCR來篩選抗原，另一方面通過在K562細胞系中穩定表達CD80和HLA-DM，構建出了強大的人工APC（aAPC），可以通過內源性II類抗原加工途徑自然加工並呈遞多肽，從而給任何給定的TCR篩選蛋白質抗原提供了有效的方法。
該方法顯示出了一系列優勢：
首先，小鼠研究中僅有少數幾個MHC等位基因限制，而在人體研究中涉及超過20,000種HLA等位基因，所以需要一個體外細胞系統來穩定表達HLA等位基因。穩定表達CD80和HLA-DM的K562細胞系可作爲強大的人工APC（aAPC），可以表達任意的HLA等位基因進行篩選。
其次，aAPC可以通過內源性II類抗原加工途徑自然加工並呈遞肽抗原，促使作者們發現蛋白質與肽刺激之間的差異。
第三，在整個研究中，TCR激活被用來捕獲抗原特異性T細胞並發現抗原，因此它可以捕獲具有低TCR親和力的抗原，通過依賴強結合親和力的測定法可能會遺漏這些抗原。
第四，作者的報告系統使用EC50來測量TCR和多肽MHC的相互作用。這種定量測量將有助於鑑定最具免疫原性的抗原，以及識別能力最強的TCR。
綜上所述，本文有效地把病原體特異性CD4+ T細胞庫分析和尋找新抗原結合起來，併成功地解碼了T細胞對於Mtb病原體的反應。
該平臺也可以用於研究其他與疾病相關的T細胞反應，例如瘧疾，腫瘤和自身免疫性疾病中T細胞的功能。
論文信息：
DOI：https://doi.org/10.1038/s41587-020-0505-4
參考文獻
1. Altman, J.D. et al. Phenotypic analysisof antigen-specific T lymphocytes. Science274, 94-96 (1996).
2. Hadrup, S.R. et al. Parallel detection of antigen-specific T-cell responses by multidimensionalencoding of MHC multimers. Nat Methods6, 520-526 (2009).
3. Newell, E.W., Klein,L.O., Yu, W. & Davis, M.M. Simultaneous detection of many T-cellspecificities using combinatorial tetramer staining. Nat Methods6, 497-499(2009).
4. Newell, E.W. et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cellepitope mapping and characterization. NatBiotechnol31, 623-629 (2013).
5. Bentzen, A.K. et al. Large-scale detection of antigen-specific T cells using peptide-MHC-I multimerslabeled with DNA barcodes. Nat Biotechnol34, 1037-1045 (2016).
6. Zhang, S.Q. et al. High-throughput determination of the antigen specificities of T cell receptorsin single cells. Nat Biotechnol(2018).
7. Glanville, J. et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire. Nature547, 94-98 (2017).
