Cell Research | 歐陽松應組在CRISPR-Cas13b結構與功能方面取得重要進展

責編丨迦漵

原核生物中存在一種規律成簇的間隔短迴文重複DNA 序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）。CRISPR表達的非編碼RNA（CRISPR RNA，crRNA）及其相關蛋白（CRISPR associated protein, Cas）組成的複合物在原核生物中形成一種能夠抵禦噬菌體和外來核酸入侵的防禦系統，即CRISPR-Cas系統。CRISPR-Cas系統的家族成員Cas9和cpf1（又名：Cas12a）具有RNA指導的DNA內切酶活性，已經被開發成爲衆所周知的具有重大應用前景的基因編輯工具，並且已經成功用於人類細胞的基因組編輯與改造。與之不同的是，CRISPR-Cas系統Ⅵ型Cas13b蛋白是一種新型的RNA指導的RNA內切酶，不僅具有pre-crRNA加工活性，同時還具備靶向RNA的切割活性，從而保護宿主抵抗病毒等外源RNA核酸物質入侵。

2018年11月13日，福建師範大學歐陽松應教授課題組在Cell Research雜誌在線發表了題爲Structural insights into Cas13b-guided CRISPR RNA maturation and recognition的研究成果。該研究解析了動物潰瘍伯格菌（Bergeyella zoohelcum）中Cas13b（BzCas13b）與CRISPR RNA（crRNA）二元複合物的晶體結構，揭示了precursor crRNA（pre-crRNA）成熟加工的酶活位點，闡明瞭crRNA成熟的分子機制。

在本研究中，BzCas13b蛋白全長由1224個氨基酸殘基構成，它包括了多個結構域。在解析的其與crRNA二元複合物晶體結構中（分辨率爲2.79 Å），研究發現BzCas13b的多結構域以L型crRNA爲中心環繞分佈，整體呈現出三角形空間結構，其Helical-1，HEPN-1 and HEPN-2結構域構成三角形結構的一邊，RRI-1、RRI-2結構域和linker region一起構成三角形結構的另一邊，Helical-2結構域構成三角形結構的第三邊。成熟的crRNA也包括了4個亞區域。

結合結構生物學和體外生物化學等實驗手段，該研究首次揭示了加工pre-crRNA的蛋白酶活位點，發現了pre-crRNA被加工的重要位點，校正了以往相關研究領域中不準確的研究內容，並且進一步闡明瞭crRNA的識別機制。另外，之前的相關研究表明，來自BzCas13b的兩個HEPN結構域的氨基酸殘基R116，H121，R1177和H1182參與了靶RNA的切割，本研究內容證明了單個R116A或R1177A突變足以破壞該蛋白的靶RNA切割活性。

BzCas13b蛋白全長三維晶體結構與關鍵酶性功能位點解析

據悉，福建師範大學生命科學學院及南方生物醫學研究中心爲本研究成果的第一單位，歐陽松應教授爲本文的獨立通訊作者，福建師範大學生命科學學院青年教師張博博士和研究生葉維偉爲本文的共同第一作者。

此外，近日歐陽松應教授課題組還在Protein & Cell雜誌在線發表了題爲Structural basis of AimP signaling molecule recognition by AimR in Spbeta group of bacteriophages的研究論文，解析了Spbeta噬菌體羣體感應受體分子（AimR）與信號分子多肽AimP結合前後的晶體結構，揭示了噬菌體羣體感應受體識別的分子機理。

羣體感應作爲細菌間信息交流的一種的重要方式，調控着細菌許多重要的生理功能，可以作爲替代抗生素的靶標，吸引了許多研究者的興趣。2017年，發表在Nature上的文章最早在病毒-噬菌體中發現了羣體感應系統，並且初步證實噬菌體羣體感應系統在噬菌體溶源-裂解途徑的選擇過程中起到至關重要的功能，但是，其具體分子機理不清楚。在此基礎上，歐陽松應教授課題組解析了這一系統中關鍵蛋白的結構，通過對結構分析，可以瞭解噬菌體羣體感應發揮功能的結構基礎，將爲噬菌體治療以及其它抗病毒研究提供結構基礎。