免疫檢查點抑制劑療法 （CPIS）的出現，給惡性腫瘤的治療和總體生存帶來了很多驚喜，但在臨牀上，大部分惡性腫瘤合併肝轉移的患者，比如黑色素瘤、肺癌、腎癌等，接受免疫治療的療效都是比較差的，明顯比沒有肝轉移的患者差很多，爲什麼呢？現在終於有答案了！

《SCIENCE IMMUNOLOGY》 2020 年 10 月發表的一篇美國加州大學的研究報告對此做出瞭解釋。

肝轉移可調節全身抗腫瘤免疫，而這些患者 CPI 抵抗背後的機制基礎還不清楚。以前對肝臟耐受性的研究要麼集中在癌症以外的環境 （如傳染病、移植、自身免疫性疾病），要麼就是提示肝轉移前的潛在可能和癌症相關的免疫抑制是基於肝實質範圍內的局部效應。

但是這些研究均不能解釋肝臟耐受性對全身或非穩態抗腫瘤免疫的潛在影響，更不能解決臨牀上的問題。因此，我們迫切需要了解肝轉移 CPI 治療失敗的機制，並找出可能提高療效的策略。

一、肝臟腫瘤降低遠處抗腫瘤免疫以及抗 PD-1 免疫治療的全身反應

圖 1

該研究發現，將同基因 MC38 腫瘤細胞皮下注射給無免疫能力的 C57BL/6（B6）小鼠，同時將MC38細胞注射到肝臟或肺部（圖1A），肝臟內腫瘤小鼠的遠處SQ腫瘤的腫瘤生長明顯增加（圖1B）。

既往研究表明，活化標記物 PD-1 和 CTLA-4 在 CD8+TILs 上的高水平表達與腫瘤免疫有關，並預測對CPI有更好的療效。

該研究分析了三組腫瘤浸潤 CD8+T 細胞表面 PD-1 和細胞內 CTLA-4 的表達發現，與患有肺腫瘤的小鼠和對照鼠（僅限 SQ 腫瘤）相比，攜帶肝臟腫瘤的小鼠的 SQ-CD8+TIL上PD-1 和 CTLA-4 表達的百分比顯著降低（圖 1C）。

爲了驗證抗PD-1免疫治療對該模型的影響，研究者對三組小鼠注射了抗小鼠 PD-1 單克隆抗體（mAb），發現攜帶 SQ 和肝臟腫瘤的小鼠對抗 PD-1 單藥治療不敏感（圖 1 D和E），且肝腫瘤小鼠存活率降低和抗 PD-1 應答率低與肝毒性或肝臟疾病無關功能。從荷肝腫瘤小鼠分離的 SQ-CD8+TIL 上，PD-1 和 CTLA-4 共表達細胞的頻率顯著降低，CTLA-4 和 PD-1 的平均熒光強度（MFI）較低（圖 1F）

二、肝臟促進遠期腫瘤抗原特異性免疫抑制，而不受腫瘤負荷的影響

圖 2

爲了研究腫瘤負荷的增加是否是免疫抑制的原因，將等量的腫瘤植入不同的宿主解剖部位，以檢測對遠處 SQ 部位的免疫抑制作用。

免疫缺陷型 NOD-scid-gamma（NSG）或 Rag-1–/− 小鼠植入繼發性肝腫瘤後，SQ 腫瘤生長沒有顯著差異（圖 2B），這表明遠端 SQ 部位腫瘤生長的調節依賴於適應性免疫。將 ir 輻射的 MC38 腫瘤細胞單獨植入腫瘤內腫瘤生長顯著增加（圖 2B）。10 倍種植-少輻射MC38腫瘤細胞顯示出相似的結果（圖 2C）。將一個無關的 B16F10 腫瘤植入肝臟並不能促進遠處 SQ 部位的腫瘤生長（圖 2D），說明肝臟介導的免疫抑制是腫瘤抗原特異性的。

圖 3

三、肝轉移與 TILs 的表型變化有關

除上述 PD-1 和 CTLA-4 外，其他激活標誌物，包括誘導性T細胞協同刺激物 （ICOS）和效應細胞因子，也被證明因肝臟腫瘤的存在而改變，並與抗腫瘤反應相關。

在肝轉移小鼠中， CTLA-4、ICOS和干擾素 γ （IFNγ）的表達在分離的 CD8+T 細胞上顯著降低（圖 3 B、C）。而且基於多種激活標記物 PD-1、CTLA-4、ICOS 和 Ki-67 的共同表達，大多數高活性 T 細胞亞羣受到的影響最爲顯著。常規 CD4+TILs 在 SQ 腫瘤內荷肝腫瘤小鼠的 ICOS 表達較低，但 PD-1 表達較高（圖 3B）。表明傳統 CD4+TIL 上 ICOS 的表達與增強的抗腫瘤免疫有關，而 PD-1 的高表達與抗腫瘤反應的降低相關。

圖 4

雖然 Foxp3+Tregs 的百分比和絕對 Treg 數無顯著差異 （圖 4 A 和 B），但肝轉移小鼠的腫瘤組織中 PD-1、CTLA-4 和 ICOS 的表達顯著高於對照組 （圖 3D）。在第二個腫瘤模型 B16F10 黑色素瘤模型中進行了類似的實驗，觀察到了相似的結果，即小鼠與同種肝腫瘤共同注射後，SQ 腫瘤的生長顯著增強，並且降低了激活標記物和細胞因子在與 SQ 腫瘤相關的細胞毒性T細胞中的表達 （圖 S5）。

四、Tregs 控制肝腫瘤遠處腫瘤免疫的抑制

圖 5

大量證據表明，Tregs 在肝臟免疫耐受中起着重要作用，並能抑制 CD8+T 細胞活性和細胞毒性。因此，在 Foxp3 （FP3-DTR）的控制下，使用表達白喉毒素 （DT）受體的小鼠株選擇性地消耗 Tregs，以檢測 Tregs 在系統抑制中的潛在影響。結果表明Tregs參與了肝臟腫瘤特異性抑制 （圖 3G）。此外，基於 ICOS、IFNγ 和 CD107a 表達的顯著增加，Tregs 的缺失恢復了腫瘤特異性CD8+T細胞的激活和功能狀態 （圖 3H和I）。DT 處理組 PD-1 表達較低。這一結果可能是由於腫瘤負荷減少 （由 Treg 耗竭引起）引起。總的來說，在肝臟腫瘤存在的情況下， Tregs 在調節遠處腫瘤特異性 CD8+T 細胞免疫中起着關鍵作用。

五、Treg 缺失或失活逆轉肝臟腫瘤相關的全身免疫抑制

以上結果提示，Tregs 可能是抗 PD-1 單藥治療不能誘導腫瘤消退的原因。因此，該研究使用兩種獨立的方案來選擇性地破壞 Tregs，看看它是否能與抗 PD-1 治療協同作用。結果表明，在抗 PD-1 單藥無效的肝腫瘤介導免疫抑制中，包括 PD-1 檢查點阻斷和 Treg 功能耗竭或破壞的聯合策略可以增強持久的抗腫瘤免疫。

爲了驗證 Treg 耗竭對抗 CTLA-4 活性，比較兩種藥物的抗腫瘤作用，發現只有 Treg 缺失的 IgG2a 抗體能夠在兩個部位實現腫瘤的完全排斥。

肝臟 Tregs 表型分析和抑制抗腫瘤免疫效應

鑑於 Tregs 在肝腫瘤模型中的全身免疫抑制中起着重要作用，該研究試圖直接比較有無肝腫瘤的小鼠的體內抑制能力，以確定 Treg 羣體是否存在功能差異。結果表明，肝臟腫瘤的存在誘導了一個高度活躍的 Tregs 羣體，在每個細胞的基礎上更有效地抑制抗腫瘤免疫。

腫瘤中天然免疫細胞的微環境影響抗腫瘤免疫中表達基因和蛋白質

先天性腫瘤微環境中的免疫細胞重編程與抗腫瘤反應高度相關。因此，該研究利用 scRNA 序列分析了先天性免疫室細胞的轉錄組，發現僅在 SQ 腫瘤的單核細胞亞羣中，表達與免疫抑制相關基因的細胞較少組，包括 Socs3、Xbp1、Rhoh、Wfdc17、GOs2 和 Acod1，表明肝腫瘤誘導的免疫抑制可能是 Tregs 和MDSC cross-talk 的結果。

肝腫瘤相關的 Treg 控制遠端抗原特異性免疫是由耐受性 CD11b 介導的 MDSCs

以前的研究表明 Tregs 可以通過改變抗原呈遞細胞 （APCs）間接地對效應T細胞產生腫瘤抗原特異性抑制。提示系統性抗原特異性免疫調節機制可能與 Tregs 和 MDSCs 相互協調。該研究用 14 色熒光筆對 SQ 腫瘤微環境中的髓系/單核細胞/巨噬細胞系細胞進行了觀察，結果發現，肝腫瘤組的兩組細胞 CD11b+Ly6G+Ly6C- 粒細胞 MDSCs （G-MDSCs）顯著增加以及 CD11b+Ly6G−Ly6C+ 單核MDSCs （M-MDSCs）。CD11b+MDSC 浸潤增加， CD80/86 表達增加，僅在合併肝臟腫瘤的情況下發生，而在其他解剖部位腫瘤並沒有。

對不穩定SQ腫瘤的分析表明，Tregs 的耗竭導致浸潤性MDSCs的百分比降低 （圖6C）。此外，腫瘤微環境中剩餘的 CD11b+ 單核細胞表達更高水平的 CD80/86 ，提示它們在腫瘤微環境中的功能可能被重新編程爲成爲能夠向T細胞提供共刺激的 APCs （圖 6D）。

爲了驗證 Tregs、CTLA-4 和 MDSCs 的關係，該研究比較了兩種不同類型的小鼠抗 CTLA-4 抗體克隆 9D9。無論是用 Treg 缺失抗體還是非缺失抗體治療，CD45+CD11b+MDSCs 上的CD80/86 表達增加；然而，只有 Treg 缺失 IgG2a 抗體導致超高壓單核細胞數量減少（圖 6，G 至 I）。

類似於反 -CTLA-4 9H10 抗體，只有 Treg 消耗 IgG2a 抗體。當結合抗 PD-1 抗體治療時，治療能夠在大多數治療小鼠的兩個部位實現腫瘤的完全排斥。因此，雖然 CTLA-4 阻斷可以恢復 MDSCs 上共刺激表面 CD80/86 的表達，但 Treg 的耗竭可能是進一步阻止任何抑制性 MDSCs 進入腫瘤微環境的必要條件，並且在存在肝臟腫瘤的情況下實現最大的全身抗腫瘤免疫。

圖 6

在腫瘤轉移部位進行的抗腫瘤免疫治療可以顯著降低腫瘤遠處轉移的免疫反應取決於 Tregs 和 MDSCs 之間的 cross-talk。肝臟繼發性腫瘤導致腫瘤特異性免疫和 SQ 位點抗 PD-1 免疫治療反應的顯著抑制。

總之，肝臟腫瘤不僅損害肝內免疫功能，還影響遠期的抗腫瘤免疫，並導致臨牀上系統性抗 PD-1 治療的療效降低。爲了揭示導致 CPI 免疫治療抵抗的潛在耐受機制，研究利用雙腫瘤免疫活性小鼠模型，發現對肝臟內腫瘤抗原存在的免疫反應導致抗腫瘤的全身抑制免疫。免疫抑制是抗原特異性的，與調節性 T 細胞 （Tregs）的協同激活和腫瘤內 CD11b 的調節有關。功能失調的免疫狀態可能抗 PD-1 單一療法不能逆轉，除非 Treg 細胞被耗盡 （抗 CTLA-4）或使用 zeste2 （EZH2）抑制劑增強子的功能性抑制，可恢復全身抗腫瘤免疫和 CPI 反應。因此，臨牀上治療惡性腫瘤肝轉移想要取得更好的療效應該選擇抗 PD-1 聯合其他靶向治療。

六、臨牀上肝轉移的治療展望

儘管在臨牀上肝轉移的療效較差，但是與傳統治療或不治療相比較，免疫治療對這部分患者還是能帶來一線希望。比如在KEYNOTE 001、002、006臨牀研究隊列亞組分析中， PD-1 對黑色素瘤及 NSCLC 肝轉移患的緩解率超過了其他傳統療法所報告的緩解率。結合目前的相關研究，免疫治療的聯合用藥是肝轉移治療的趨勢。

那與化療聯合呢？

IMpower130 及 IMpower132 研究中，肝轉移亞組的患者使用免疫治療聯合化療並未取得顯著的生存獲益。

聯合化療+抗血管新生呢？

IMpower150 研究，肝轉移亞組獲益優於非肝轉移亞組的數據，可能由於抗血管生成藥物與免疫治療藥物具有協同抗腫瘤的作用。

聯合局部治療也是可選擇方案之一，比如立體定向身體放療 （SBRT）、經動脈化學栓塞 （TACE）等聯合免疫治療在肝轉移患者也能取得一定療效。

目前有 PD-L1/CTLA-4 雙抗體、PD-L1/TGF-B 雙抗體等臨牀研究正在如火如荼進行當中，希望這些新的藥物能夠給肝轉移患者帶來更好的療效。

本文首發：邱立新醫生

策劃：GoEun

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