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總生物鹼的提取

揮發性生物鹼如麻黃鹼可用水蒸氣蒸餾法提取。

可昇華的生物鹼如咖啡鹼可用昇華法提取。

提取方法

溶劑

方法

純化

水或酸水提取法

0.1%～l%的硫酸、鹽酸或醋酸、酒石酸溶液

浸漬、滲漉、迴流、連續迴流

（1）陽離子樹脂交換法

（2）萃取法

醇類溶劑提取法

甲醇、乙醇

酸水-鹼化-萃取法處理去除脂溶性雜質

親脂性有機溶劑提取法

三氯甲烷、苯、乙醚以及二氯甲烷等

同上

附：陽離子交換樹脂法

將總鹼的酸水提取液通過強酸型陽離子交換樹脂柱，使酸水中生物鹼陽離子交換在樹脂上，而非生物鹼化合物則流出柱外，用中性水或乙醇進一步洗除柱中的雜質。

將交換後的樹脂晾乾，用氨水鹼化至pH值爲l0左右，使生物鹼從樹脂中游離出來，再用三氯甲烷或乙醚等有機溶劑迴流提取，回收溶劑即可得到總生物鹼。也可用含氨水的乙醇洗脫液直接洗脫，中和洗脫液，回收乙醇即得總生物鹼。

生物鹼的分離

（一）生物鹼的初步分離

將總生物鹼按鹼性強弱、酚性有無及是否水溶性初步分成5個部分，一般分離流程如下：

（二）生物鹼單體的分離

1.利用生物鹼的鹼性差異進行分離

方法：酸水-鹼化-萃取法

注意：

①強鹼在弱酸性條件下能形成生物鹼鹽，易溶於水；弱鹼則需在較強酸性條件下形成生物鹼鹽而溶於水。

②成鹽後，弱鹼鹽在弱鹼條件下即可轉變成遊離生物鹼，易溶於親脂性有機溶劑；強鹼鹽則需在較強鹼性條件下轉變成遊離生物鹼，溶於親脂性有機溶劑。

總鹼中各生物鹼的鹼性不同，可用pH梯度萃取法進行分離。

具體方法有兩種：

①總生物鹼溶於親脂性有機溶劑， pH由高至低依次萃取，生物鹼可按鹼性由強至弱先後成鹽依次被萃取出而分離

②總生物鹼溶於酸水，逐步加鹼使pH值由低至高分離。

對於鹼性有差別的兩種生物鹼，可採用調pH後簡單萃取法分離。如從洋金花的乙醇浸出液中分離莨菪鹼和東莨菪鹼，利用二者鹼性差別，將乙醇浸出液濃縮後鹼化到pH 9～10，三氯甲烷萃取，三氯甲烷萃取液再用稀酸水萃取，將此酸水液用固體碳酸氫鈉鹼化後以三氯甲烷萃取，東莨菪鹼因鹼性小遊離出來而被萃取出。水層再用氨水鹼化至pH l0，用三氯甲烷可萃取出鹼性稍強的莨菪鹼。

2.利用溶解度差異進行分離

遊離生物鹼：如苦蔘中苦蔘鹼和氧化苦蔘鹼的分離

（氧化苦蔘鹼的極性大於苦蔘鹼，難溶於乙醚）

漢防己中漢防己甲素和漢防己乙素的分離

（漢防己甲素的極性小於漢防己乙素，可溶於冷苯）

生物鹼鹽：如麻黃中分離麻黃鹼、僞麻黃鹼

（在草酸中溶解度不同，麻黃鹼溶解度小於僞麻黃鹼）

3.利用特殊官能團進行分離

含羧基的生物鹼能與碳酸氫鈉生成羧酸鹽而溶於水，可與其他鹼分離；

酚性生物鹼的酚羥基具有弱酸性，可與氫氧化鈉溶液生成鹽溶於水，而與其他非酚性生物鹼分離。如在阿片生物鹼中，嗎啡具酚羥基而可待因無酚羥基，可用5%氫氧化鈉分離。

內酯或內酰胺結構的生物鹼可在鹼性水液中加熱開環生成溶於水的羧酸鹽而與其他生物鹼分離，在酸性下又環合成原生物鹼而沉澱，如喜樹鹼。

4.利用色譜法進行分離

（1）吸附柱色譜

常用氧化鋁或硅膠作爲吸附劑，有時也用纖維素、聚酰胺等。以苯、氯仿、乙醚等親脂性有機溶劑或以其爲主的混合溶劑系統作洗脫劑。

（2）分配柱色譜

對某些結構特別相近的生物鹼，可採用分配色譜法。

如三尖杉中的抗癌生物鹼三尖杉酯鹼和高三尖杉酯鹼的分離，兩者結構僅差一個亞甲基。具體方法是以硅膠爲支持劑，以pH 5.0緩衝液爲固定相，pH 5.0緩衝液飽和的三氯甲烷溶液洗脫，首先洗脫的是高三尖杉酯鹼，中間部分是二者的混合物，最後部分是三尖杉酯鹼。

5.高效液相色譜法（HPLC）

優點：分離效能好、靈敏度高、分析速度快。

色譜柱類型：硅膠吸附色譜柱，C18反相色譜柱。

此外，製備型薄層色譜、幹柱色譜、中壓或低壓柱色譜等也常用於分離生物鹼。

水溶性生物鹼（季銨鹼）的分離

（一）沉澱法

實驗室常用雷氏銨鹽試劑純化季銨鹼。

（二）溶劑法

利用水溶性生物鹼能夠溶於極性較大而又能與水分層的有機溶劑（如正丁醇、異戊醇或氯仿-甲醇的混合溶劑等）的性質，用這類溶劑與含這類生物鹼的鹼水液反覆萃取，使水溶性生物鹼與強親水性的雜質得以分離。

生物鹼的色譜檢識

常用方法：薄層色譜法、紙色譜法、高效液相色譜法和氣相色譜法

（一）薄層色譜法

1.吸附薄層色譜法

（1）吸附劑

吸附劑常用硅膠和氧化鋁。

硅膠適用注意：硅膠爲酸性吸附劑，易造成拖尾或復斑，影響分離效果。可在塗鋪硅膠薄層時加稀鹼（0.1～0.5mol/L氫氧化鈉）或緩衝溶液，製成鹼性薄板；或使色譜過程在鹼性條件下進行，即在展開劑中加入少量鹼性試劑，如二乙胺、氨水等。

氧化鋁本身顯弱鹼性，不經處理便可用於分離和檢識生物鹼，一般較常用，特別適合分離親脂性較強的生物鹼。

（2）展開劑

展開劑系統多以親脂性溶劑爲主，一般以三氯甲烷爲基本溶劑。

若Rf值太小，加入適量甲醇、丙酮等極性較大的溶劑；

若Rf值太大，加入適量苯、環己烷等極性較小的溶劑。

在展開劑中加入少量鹼性試劑，如二乙胺、氨水等，可改善分離效果。

2.分配薄層色譜

特別適用於分離有些結構十分相近的生物鹼。

（1）支持劑與固定相：

通常選用硅膠或纖維素粉作支持劑，以甲酰胺或水爲固定相。

甲酰胺適合分離弱極性或中等極性的生物鹼；水適合分離水溶性生物鹼。

（2）展開劑：

分離脂溶性生物鹼，應以親脂性有機溶劑作展開劑，如三氯甲烷-苯（1：1）等；

分離水溶性生物鹼，則應以親水性的溶劑作展開劑，如BAW系統（正丁醇-乙酸-水=4：1：5，上層）。

在配製流動相時，需用固定相飽和。

3.顯色方法

①有色生物鹼可直接觀察斑點；

②具有熒光的生物鹼在紫外光下顯示熒光斑點；

③大多生物鹼的薄層色譜可用改良碘化鉍鉀試劑顯色，顯橘紅色斑點。（如碘化鉍鉀不顯色，可選用其他特殊顯色劑）

（二）紙色譜

生物鹼的紙色譜多爲正相分配色譜。

1.固定相

①水：可用濾紙本身含有的6%～7%水分，也可用水浸潤濾紙；

②甲酰胺：將甲酰胺溶於丙酮，再將濾紙置於其中浸溼片刻，取出，揮去丙酮即可；

③酸性緩衝液（也稱多緩衝紙色譜）：將不同pH值的酸性緩衝液自起始線由高到低間隔2cm左右的距離塗布若干個緩衝液帶，晾乾即可使用。

2.展開劑

以水作固定相的紙色譜，宜用親水性溶劑系統作展開劑，如BAW系統（正丁醇一乙酸一水=4：1：5，上層）；

以甲酰胺和酸性緩衝液作固定相的紙色譜，多以苯、三氯甲烷、乙酸乙酯等親脂性有機溶劑爲主組成的溶劑系統作展開劑。

展開劑在使用前也需用固定相液飽和。

3.顯色劑

紙色譜所用的顯色劑與薄層色譜法基本相同，但含硫酸的顯色劑不宜使用。

（三）高效液相色譜

生物鹼的高效液相分析可採用分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法等。其中以分配色譜法中的反相色譜法應用較多。

根據生物鹼的性質和不同的色譜方法可選擇相應的固定相。

由於生物鹼具鹼性，使用的流動相以偏鹼性爲好。

如用HPLC法分離分析罌粟殼中的嗎啡、可待因和罌粟鹼時，採用Waters μ-Bondapak C18色譜柱，流動相爲0.5%乙酸銨-1%三乙胺-甲醇（49：1：50），檢測波長230nm，柱溫25℃。分離結果見圖2-2。由於流動相爲偏鹼性系統，分離效果良好。分離度均大於1.5，峯形對稱。

此外，具有揮發性的生物鹼可用氣相色譜法檢識，如麻黃生物鹼、菸鹼等。