圖片來源：Aimee Silla

如今，包括蛙類在內，兩棲動物的滅絕速度超過了世界上的任何其他脊椎動物。科學家和環保人士爲它們建立了多個人工繁殖基地，卻依舊無法緩解這種趨勢。如何使瀕危物種中僅剩的幾隻繁殖後代，緩解物種危機成爲新的難題。但隨着育種技術的發展和人造棲息地的多樣化，未來或許我們還能聽到一些瀕危蛙類的叫聲。

撰文 | Stephanie Pain

翻譯 | 於穎卓

審校 | 楊心舟

大量蛙類步入瀕危

幾年前，我意外地收到了朋友的一封郵件。這位朋友是蛙類愛好者，他在郵件中寫道：“Toughie死了。”Toughie是一隻巴拿馬樹蛙（Rabb‘s fringe-limbed tree frog），這隻樹蛙曾在全球擁有衆多的粉絲，而我也是其中之一。Toughie長得非常可愛，但它卻因爲一個殘酷的事實而出名：它是世界上最後一隻巴拿馬樹蛙。作爲滅絕危機中種羣的唯一倖存者，Toughie經歷了衆星捧月但又十分短暫的一生。

Toughie（圖片來源：wikipedia）

2005年，一個動物保護小組從巴拿馬一處偏遠的雲霧森林中，捕獲了Toughie和另外4只巴拿馬樹蛙，並將它們帶到美國進行人工繁殖，希望以此來阻止巴拿馬樹蛙的滅絕。由於蛙壺菌的感染，該物種很快就從野外消失了，隨後人工繁殖也宣告失敗。到2012年，Toughie成了最後的倖存者，而它也於2016年9月去世。雖然我們早就知道Toughie終將離去，但這並不能夠減輕我們受到的打擊。

今年，我一直關注着一隻來自玻利維亞的西溫克斯水蛙（Sehuencas water frog）的命運。這隻英俊的水蛙名叫Remeo（羅密歐），十年來獨自生活在玻利維亞的科恰班巴自然歷史博物館的水族館裏。它曾反覆嘗試尋找伴侶，但均未成功。2017年底，Remeo放棄了對異性的呼喚，它似乎註定要面臨與Toughie相同的命運。幸運的是，由於網絡上其他人的幫助，這隻西溫克斯水蛙有了避免孤獨終老的機會。

去年情人節的那天，Remeo的飼養員在網站上發佈了Remeo的資料。這一舉動帶來的大量捐款，資助和支持了另一支探險隊的野外水蛙尋找工作。今年1月，博物館宣佈探險隊發現了5只水蛙，其中包括2只雌性。鑑於野外黯淡的生存前景，探險隊把它們帶回了水族館。Remeo終於找到了屬於自己的另一半，而它被取名爲Juliet（朱麗葉）。

Remeo（圖片來源：美國物理學會）

每個春天，我家後院的青蛙似乎會抓住一切機會大量產卵，所以我天真地猜測Remeo的“婚後”生活也會十分順利，並熱切期待着小蝌蚪們的消息。然而結果不容樂觀，被圈養的水蛙似乎並沒有太大的繁殖熱情。如果西溫克斯水蛙這樣的瀕危動物不進行交配產卵，怎樣才能拯救它們呢？

對於蛙和蟾蜍來說，我們可以用生殖技術來解決這一問題。隨着兩棲動物激素療法、人工受精和冷凍保存技術的迅速發展，人工圈養蛙類誕下健康後代的機率也開始提高。而目前受益於這些技術的瀕危物種還很少，但正如澳大利亞伍倫貢大學的生殖生物學家Aimee Silla所說，這些技術預計能爲更多的瀕危動物提供幫助。Silla和同事Phillip Byrne在《動物生物科學年度評論》中報道了該領域取得的成就。她說：“這些技術具有很大的應用潛力，而且激動人心的突破層出不窮，因此我們有理由保持樂觀。”

地球上的生物多樣性正在以空前的速度削減，而兩棲動物首當其衝，其數量減少速度超過了任何脊椎動物羣體。2017年，世界自然保護聯盟（IUCN）列出了大約2100種瀕臨滅絕的兩棲動物，幾乎佔已知兩棲動物物種的32%。根據IUCN的估計，這一數字可能還會繼續上升至55%左右。

其實我們很熟悉兩棲動物數量銳減的幕後元兇——棲息地消失、氣候變化、環境污染、被作爲食物過度掠取和愈演愈烈的野生動物貿易。但現在還加上有史以來最嚴重的兩棲動物傳染病，即壺菌病（chytridiomycosis）。最近，科學家對該病的影響進行了評估，結果表明，這種可怕的真菌感染疾病導致了500多種兩棲動物的數量減少，更有90種兩棲動物因此滅絕。

20世紀80年代後期，爬蟲學家首先敲響了物種滅絕的警鐘，並最終促成了科學界對蛙類、蟾蜍及它們的近親進行的全球評估。2004年發佈的結果令人震驚：各地的兩棲動物數量都在直線下降，一些物種甚至已經消失。2005年，國際專家舉行了一次峯會，以制定相應的保護措施。其中一項重要的提議是，動物園、水族館和其他有能力的組織應設法“拯救”瀕危物種和進行圈養繁殖。

倘若一切順利，這些“人造保護性棲息地”將在一定程度上保留瀕危物種的遺傳多樣性。如果有合適的棲息地，剩餘的後代可以被放歸野外，幫助增加或者恢復日漸減少的種羣數量。

在這項計劃中，許多環境保護人士帶回了珍稀的蛙和蟾蜍，被圈養的兩棲動物數量激增。其中的一些繁殖計劃取得了巨大的成功。例如，馬略卡島產婆蟾（Mallorcan midwife toad）已在野外重新建立了18個繁殖種羣，脫離了瀕危物種的清單。坦桑尼亞的奇罕西噴霧蟾蜍（Kihansi spray toad）於2009年被宣佈在野外滅絕，因爲當地的一個水利項目破壞了它們在奇罕西峽谷瀑布旁的、充滿水霧的棲息地。於是人們設法爲圈養繁殖的噴霧蟾蜍，製造了適合生存的水霧環境，而這一努力也得到了回報，成千上萬人工飼養的噴霧蟾蜍被放歸到了奇罕西峽谷的人造水霧棲息地中。

馬略卡島產婆蟾。（圖片來源：維基百科）

輔助生殖技術

但對於其他許多被拯救的物種來說，情況就不太樂觀了。有些物種無法產生卵子或精子，或雌雄個體產生配子的時間不同步；有些物種不能進行必要的交配行爲；還有少數物種產生了胚胎，但胚胎很難進一步發育。密西西比州立大學的保護生物學家Andy Kouba曾研究過一些美國最罕見的兩棲動物，他表示，現在除了滅絕危機外，還存在圈養繁殖危機。

爲什麼對兩棲動物繁殖後代如此艱難？很大程度上，這主要因爲我們不夠了解稀有物種繁殖的苛刻要求。蛙和蟾蜍是極其多樣化的動物，通常具有許多高度分化的繁殖策略和習性。它們有些在水中繁殖，包括平靜的湖泊、湍急的溪流及淺淺的水池；另一些則在陸地上繁殖，從熱帶雨林的地面和樹冠，高山沼澤的苔蘚下到蘆葦叢的泡沫水池中。它們多數會通過體外受精方式繁殖，但也有一小部分是體內受精。有些是一夫一妻制，有些則採用非常混亂的多對多交配方式。

更重要的是，與交配有關的生理和行爲變化會與一系列環境和社會因素相聯繫，包括溼度、溫度或壓力的變化，更明亮、更長的白晝，同伴的呼喚，冬眠的結束，或一場突如其來、標誌着雨季開始的傾盆大雨。一旦某個物種瀕臨滅絕，我們就幾乎沒有機會在野外對其進行研究，因此很難找到交配的觸發因素。“有些時候我們可以弄清楚交配的誘因，併成功讓它們進行交配，但是對於很多其他物種，無論我們怎麼嘗試也找不到正確答案。” Kouba解釋道。

因此三種輔助生殖技術（ART）應運而生：（1）激素治療，該方法可以促使不情願的伴侶進行交配，或誘導卵子和精子的發育和釋放；（2）體外受精，增加後代的數量和多樣性；（3）精子或卵子冷凍技術，以備不時之需。

少數瀕危物種已經從這三種技術中受益。例如，在澳大利亞，激素治療將不願意配對的科羅澳擬蟾（northern corroboree frog）變成了熱情似火的戀人，這樣能確保它們都爲下一代貢獻了自己的基因。來自美國拉勒米平原的懷俄明蟾蜍（Wyoming toad）在野外已滅絕，但多虧了激素和人工受精技術，它們的種羣數量又開始恢復。另外，冷凍的精子也爲落基山脈南部瀕臨滅絕的西部蟾蜍（Anaxyrus boreas）貢獻了一些後代。

西部蟾蜍。（圖片來源：維基百科）

但是要完成這些工作其實並不容易。儘管近70年來科學家一直在開展一些基礎研究，來使用激素和體外受精技術培育兩棲動物胚胎，但到了20世紀90年代，當生物學家試圖藉助這些技術來增加更多的兩棲動物數量時，他們發現實驗室的那套流程只適用於特定的對象，因而無法在野外直接採用。經過數年對激素劑量的調整和測試，第一種有效的治療方法才最終確立。另外，哪怕只是將精子和卵子融合這樣的簡單任務，也耗費了不少精力。

隨着人造保護性棲息地數量的迅速增加（許多仍然無法進行自然繁殖），人們的緊迫感日益增強。“我們意識到，這項研究必須抓緊進行，”Silla表示。而現在，辛苦的工作得到了回報。她補充說：“近年來，輔助生殖技術發展得很快。”

激素療法之所以能夠刺激性腺成熟以及卵子和精子釋放，主要依靠兩種激素注射：促性腺激素釋放激素和人絨毛膜促性腺激素（一直到20世紀70年代，這些激素實驗主要爲了研究人類的妊娠行爲）。有些物種對第一種激素的反應最好，而另一些物種則更適合第二種，同時注射劑量和方案也至關重要。Kouba表示：“每個物種都不相同，因此要找到合適的激素並確定治療的時間和頻率可能要花費幾年的時間。”長期以來，爲新物種找到合適的治療方案就是一個試錯的過程。如今，對於大約20個物種，科學家們已經確定了相應的激素療法。

隨着激素治療方案數量的增加，一些規律漸漸浮出水面，而這有助於科學家們找到更多合適的激素療法。例如，兩棲動物的祖先譜系似乎決定了激素的選擇，一些蛙類和蟾蜍家族的成員對第一種激素的反應更好，而其他家族的成員則更適合第二種激素。

Silla和Byrne認爲，演化因素也可能成爲預測最佳精子收集時間的關鍵，因爲雄性產生精子的數量及其釋放速度與物種的交配策略息息相關。

在非一夫一妻制的物種中，雄性之間的競爭推動了睾丸向更大的方向演化，它們會產生更多的精子並更快地將其釋放。例如西澳大利亞的佐治亞索蟾（它的別名叫quacking frog，因爲它會像鴨子一樣嘎嘎叫）是一妻多夫制，許多雄性成羣聚集在一個產卵雌性周圍。那些雄性有巨大的睾丸，裏面充滿了數以萬計的精子。注射激素後，它們會在數分鐘內開始釋放精子。不過，Silla發現最佳的收集時間是在注射7個小時後，那時精子的釋放量會達到峯值。

與之形成鮮明對比的是澳洲南部夜宴蛙（southern corroboree frog），它是生活在新南威爾士州雪山的的極度瀕危物種。這種青蛙採取一夫一妻制，這也意味着它不需要產生很多精子，也不必對交配感到着急，因此它的睾丸很小。根據Silla和Byrne的說法，在注射激素後，他們要等待很長時間才能獲得精子。Silla說：“在這種蛙中，需要注射36個小時後才能達到精子釋放的峯值，而我們最終也只收集到了幾百個精子。”

澳洲南部夜宴蛙。（圖片來源：the conversation）

配子收集後，需要的第二種技術是體外受精，它能夠讓育種者控制後代的親緣關係，從而可以在小羣體優化遺傳多樣性。雖然理論上聽起來很簡單，實踐中卻並不容易。傳統的方法是將卵子和切碎睾丸中獲得的精子放入培養皿中混合靜置幾分鐘，然後用水淹沒它們。溶液突然被稀釋會促使精子變得活躍。

但是在保護動物時，我們不能直接去獲得睾丸。取而代之的是，育種者必須等精子移動到泄殖腔並與尿液混合後才能收集它們。對於某些蟾蜍，只要把它們拎起來並放到盤子上，它們就會排出精液和尿液的混合物。如果這樣做不起作用，則可以通過對腹部施加輕微的壓力。蛙類則更難獲得精子，育種者可能需要使用細導管來完成收集工作。

此外，育種想要獲得成功還取決於精子和卵子的混合比例是否正確，是否加入了激活精子的特定液體，以及其他很多原因。

第三種技術，也就是冷凍保存技術，同樣可以提高種羣數量並確保瀕危物種的遺傳基因健康。因爲接受激素療法的兩棲動物通常產生精子和卵子的時間不同步，冷凍保存技術可以先存儲一種性別的配子，直到我們獲得另一種性別的配子。

精子的長期儲存也爲遺傳多樣性的優化開闢了新的可能性。一些收集好的卵子可以用許多不同雄性的精子來受精，動物園和水族館的種羣可以交換精子，我們甚至可以讓野生和圈養的個體進行雜交。特別是具有抵抗疾病等有特殊價值的個體，可以在死亡後的很長時間內繼續貢獻自己的基因。

但是，正如你所想的那樣，實際操作比聽起來要複雜得多。精子的儲存要比卵子更容易，精子凍存的試驗已經在越來越多的物種身上取得了成功。Kouba和同事一起創建了美國國家兩棲動物基因組庫，他表示：“最初精子解凍後恢復活性的概率只有5%，現在可以達到50%至70%。我們還可以保存活體動物體內的精子，並用它們來培育後代。”

而冷凍卵子是另一碼事：由於卵子尺寸很大，含有卵黃，水分含量高，並且還有着果凍狀厚外層，這些特徵導致科學家們至今未能成功將其冷凍。Kouba表示，這個問題必須解決。“冷凍精子確實要簡單得多，但如果只能保留雄性基因組，而那只是整個基因組圖譜的一半而已。”

建立更多育種項目

到目前爲止，儘管需求巨大，但受益於輔助生殖技術的瀕危物種數量仍然很少。在某些育種項目中，許多或所有由此產生的後代仍被圈養，以幫助維持人工棲息地的運轉。另一些則重新回到了野外：超過30萬隻波多黎各鳳頭蟾蜍（Puerto Rican crested toadlets）已被放生到了原本的島嶼，數百隻澳洲北部夜宴蛙也回到了屬於它們的亞高山沼澤地。Silla在研究過程中培育的所有澳洲北部夜宴蛙都被放生了，對此她感到十分自豪：“我很激動，這不僅是基於實驗室的研究，而且是真實的保護行動。”

波多黎各鳳頭蟾蜍。（圖片來源：維基百科）

在未來不久，也會出現更加先進的生殖技術，但我們無法很快將其應用於兩棲動物的育種工程中。而與此同時，數百種兩棲動物正瀕臨滅絕。Kouba表示：“現在最急切的需求之一就是建立更多的育種項目，以拯救更多的物種。”

有了運氣、耐心和其他一些要素，有些物種的數量或許能夠自行恢復。但對於其他物種來說，或許仍要寄希望於人類的幫助。“總體而言，與所有受到威脅的兩棲動物數目相比，我們所拯救的不過是九牛一毛。”Kouba說，“但是對於我們正在積極研究的那麼些蛙和蟾蜍而言，卻會產生舉足輕重的影響。”

坐在書桌前，我可以聽到一隻普通青蛙的叫聲。我感到很幸運，因爲英國的7種兩棲動物中有3種會來我的後院漫步，有些甚至決定常駐於此。它們還有上千種引人入勝的同伴令我想要一睹真容——從小小的寶石色的箭蛙（dart frog）和優美的玻璃蛙（glass frog）到喀喀湖的佈滿褶皺的陰囊蛙（scrotum frog）之類的大傢伙——儘管我知道我可能不會見到它們，但如果它們消失的話，我會感到十分悲傷。至於Remeo？他現在又再次開始呼喚異性了——我也仍在查看它的Twitter 賬戶是否發佈了新消息。