科学家开发新策略衡量记忆T细胞反应
免疫记忆是适应性免疫应答的重要特征，也是通过接种疫苗产生免疫保护的基础。
适应性免疫的主要参与者包括：负责呈递抗原并产生抗体的B细胞，直接杀伤受感染细胞或肿瘤细胞的杀伤性CD8+T淋巴细胞，负责调节CD8+ T细胞和B细胞功能的CD4 +辅助T细胞。
为了检测人体从感染中恢复后是否产生免疫保护，或者在接种疫苗后是否产生免疫保护，研究人员通常需要衡量相应抗原的记忆B细胞或记忆T细胞亚群比例来判断。
其中抗体效价是特异性抗体生物活性的重要标志，反应了特异性抗体与抗原的结合能力，是疾病诊断和疫苗评价等领域的重要指标，对其进行检测在临床上意义重大。
抗原特异性T细胞，由于其细胞亚群效应功能的复杂性，以及几乎无限的抗原种类，无法进行全面系统的研究。
这不仅阻碍了T细胞在疾病诊断和临床上的应用，也阻碍了针对结核病、艾滋病，疟疾和肿瘤等的疫苗开发。
因此，科研人员对于探讨病原体或肿瘤的抗原特异性T细胞应答的的兴趣日益增长，尤其是寻找更加灵敏和特异性的分析方法。
1996年，John D.Altman和Mark M. Davis开发的“四聚体”成为阐明体外抗原特异性T细胞的关键工具，对该领域的进步作出了重大贡献（1）。
值得注意的是，组合标记和DNA条码方案的使用，允许一次测试数百到数千个四聚体（2-6），使得检测的通量大幅度提高。
除了ICS和四聚体外，通过细胞因子的细胞表面捕获和抗原刺激后使用活化标记都可以用来鉴定抗原特异性T细胞。
据WHO估算，2017年全球的结核病潜伏感染人群约为17亿，潜伏感染率为23%。
全球新发结核病患者约1000万，结核病发病率为133/10万。有效的疫苗是有效预防肺结核的关键。
目前很多的证据表明T细胞在肺结核的免疫保护中起重要作用，但是一直缺乏有效的方法来最广泛的捕获结核分枝杆菌（Mtb）特异性T细胞库。
这里面有多层次原因。
首先，Mtb基因组高达4.4 Mb，包括3000多个基因，因此，无法利用合成肽段的策略作为抗原来覆盖整个蛋白质组。
其次，四聚体的研究策略常常需要一个具有代表性的HLA等位基因。由于大部分病人样品的HLA等位基因变化纷杂，以至于很难找到一个主要的代表来构建四聚体。
第三，不同的T细胞亚型可能参与了针对Mtb的保护，通过对单一的细胞因子或单一的参数进行检测就不够全面。
为了克服这些问题，美国斯坦福大学医学院的研究人员开发了一个新的策略研究抗原特异的T细胞，既可以广泛分析感染者中CD4+T细胞对Mtb的反应，又可以鉴定这些CD4+T细胞抗原。
相关论文2020年4月27日发表于《自然—生物技术》。黄璜博士和王春林博士为共同第一作者，通讯作者为Mark M.Davis教授。
该方法的第一部分是大规模的搜集Mtb特异的T细胞及其T细胞受体（TCR）。
用整个Mtb裂解物刺激PBMC，使用T细胞活化标记物CD154从PBMC中鉴定Mtb特异性T细胞，然后进行单细胞分析。
原则上，细菌裂解物涵盖了细菌中最广泛的抗原谱。
为了更好地分析已鉴定出来的大量TCR序列，作者先前开发了一种算法GLIPH，该算法可以根据序列相似性对相同特异性的TCR序列进行聚类，并根据受试者的基因型预测这些TCR聚类的HLA限制，从而帮助探寻新的抗原（7）。
在新研究中，作者们开发了一个更新版本，即GLIPH2，它可以以更高的速度、准确性和效率分析多达数百万个TCR序列。
通常，通过计算每个个体的TCR重复数来进行克隆扩增分析，人们专注于单个个体的T细胞克隆扩增变化。
与此互补的是，GLIPH2分析使我们能够从整个群体的角度关注个体之间共享的特异性，这将极大的推动疫苗候选抗原的发现。
该方法的第二部分是通过筛选Mtb的整个基因组，来寻找新的CD4+ T细胞抗原。
通过第一步的GLIPH分析，作者们确定出了上百个TCR类群。
为了确定它们的抗原，研发了一套高效的T细胞报告系统，一方面通过在细胞系J76中表达感兴趣的TCR来筛选抗原，另一方面通过在K562细胞系中稳定表达CD80和HLA-DM，构建出了强大的人工APC（aAPC），可以通过内源性II类抗原加工途径自然加工并呈递多肽，从而给任何给定的TCR筛选蛋白质抗原提供了有效的方法。
该方法显示出了一系列优势：
首先，小鼠研究中仅有少数几个MHC等位基因限制，而在人体研究中涉及超过20,000种HLA等位基因，所以需要一个体外细胞系统来稳定表达HLA等位基因。稳定表达CD80和HLA-DM的K562细胞系可作为强大的人工APC（aAPC），可以表达任意的HLA等位基因进行筛选。
其次，aAPC可以通过内源性II类抗原加工途径自然加工并呈递肽抗原，促使作者们发现蛋白质与肽刺激之间的差异。
第三，在整个研究中，TCR激活被用来捕获抗原特异性T细胞并发现抗原，因此它可以捕获具有低TCR亲和力的抗原，通过依赖强结合亲和力的测定法可能会遗漏这些抗原。
第四，作者的报告系统使用EC50来测量TCR和多肽MHC的相互作用。这种定量测量将有助于鉴定最具免疫原性的抗原，以及识别能力最强的TCR。
综上所述，本文有效地把病原体特异性CD4+ T细胞库分析和寻找新抗原结合起来，并成功地解码了T细胞对于Mtb病原体的反应。
该平台也可以用于研究其他与疾病相关的T细胞反应，例如疟疾，肿瘤和自身免疫性疾病中T细胞的功能。
论文信息：
DOI：https://doi.org/10.1038/s41587-020-0505-4
参考文献
1. Altman, J.D. et al. Phenotypic analysisof antigen-specific T lymphocytes. Science274, 94-96 (1996).
2. Hadrup, S.R. et al. Parallel detection of antigen-specific T-cell responses by multidimensionalencoding of MHC multimers. Nat Methods6, 520-526 (2009).
3. Newell, E.W., Klein,L.O., Yu, W. & Davis, M.M. Simultaneous detection of many T-cellspecificities using combinatorial tetramer staining. Nat Methods6, 497-499(2009).
4. Newell, E.W. et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cellepitope mapping and characterization. NatBiotechnol31, 623-629 (2013).
5. Bentzen, A.K. et al. Large-scale detection of antigen-specific T cells using peptide-MHC-I multimerslabeled with DNA barcodes. Nat Biotechnol34, 1037-1045 (2016).
6. Zhang, S.Q. et al. High-throughput determination of the antigen specificities of T cell receptorsin single cells. Nat Biotechnol(2018).
7. Glanville, J. et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire. Nature547, 94-98 (2017).
