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肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，其中，肝癌肿瘤微环境对于肝癌的发生发展至关重要。肿瘤浸润的单核/巨噬细胞是肝癌肿瘤微环境中最丰富的一类基质细胞，与肝癌的进程密不可分，被认为是治疗肝癌的重要靶点。因此，深入探讨肝癌细胞与肿瘤浸润的单核/巨噬细胞间的互作机制，寻找阻断它们之间相互作用的策略至关重要。肿瘤来源的胞外囊泡是肿瘤微环境中细胞间通讯的重要媒介，但是在介导肝癌细胞与肿瘤浸润的单核/巨噬细胞间通讯的作用机制及其对肝癌进程的影响尚不明确。

2020年5月28日，厦门大学生命科学学院吴乔教授团队在Molecular Cell在线发表了题为“Ectosomal PKM2 Promotes HCC by Inducing Macrophage Differentiation and Remodeling the Tumor Microenvironment”研究论文。该研究不仅发现肝癌细胞中SUMO化修饰促进PKM2靶向质膜以微囊泡的形式外泌，进而通过诱导单核细胞分化成为M2-like巨噬细胞促进肝癌进程，还揭示微囊泡PKM2可以作为一个潜在的肝癌临床诊断标志物和治疗靶点。

研究者首先提取了正常肝细胞和肝癌细胞的外泌体（Exosome）及微囊泡（Ectosome），将其分别与单核细胞共孵育，发现肝癌细胞的微囊泡而不是外泌体能够显著促进单核细胞分化。随后对这两种囊泡进行蛋白质组学分析，筛选到糖酵解通路的重要代谢酶——丙酮酸激酶PKM2（Pyruvate kinase M2）是肝癌细胞微囊泡中关键的传递蛋白（特别关注丨丙酮酸激酶M1型和M2型（PKM1/2）研究的戏剧性逆转和对Warburg效应的反思）。肝癌细胞能够以微囊泡的形式向单核细胞传递PKM2。与PKM2敲低的肝癌细胞微囊泡及正常肝细胞的微囊泡相比，肝癌细胞微囊泡可以显著上调单核细胞的糖酵解水平，引起单核细胞分化，而糖酵解抑制剂2-DG则明显抑制肝癌微囊泡的作用。单核细胞通常倾向于分化成为巨噬细胞及树突状细胞。

在上述单核细胞中进一步检测后发现肝癌细胞微囊泡PKM2能够上调单核细胞中巨噬细胞、M2型巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞等marker表达，同时抑制M1型巨噬细胞marker表达，但不影响树突状细胞marker表达。同样地，小鼠肝癌细胞微囊泡PKM2也能够诱导小鼠骨髓来源的单核细胞及外周血单核细胞分化成为巨噬细胞。因此，肝癌细胞微囊泡PKM2及其介导的糖酵解代谢重编程促进了单核细胞向M2-like巨噬细胞分化。

研究者进一步探究了肝癌细胞微囊泡PKM2及其介导的糖酵解代谢重编程诱导单核/巨噬细胞分化的分子机制。结果表明，肝癌细胞微囊泡PKM2被单核细胞吸收后，能够“双管齐下”地上调单核/巨噬细胞分化关键转录因子（包括MafB、c-Maf和Egr-1）的表达，促进单核/巨噬细胞分化。一方面，微囊泡PKM2通过诱导单核细胞糖代谢重编程，提供乙酰辅酶A用于组蛋白乙酰化修饰，促进分化关键转录因子启动子区域组蛋白H3K9和H4K8乙酰化，由此促进转录因子的转录水平。另一方面，微囊泡的PKM2还能作为一个蛋白激酶，通过激活单核细胞核内STAT3磷酸化，促进其结合到这些转录因子启动子区域的STRE应答元件，从而激活转录因子的转录。

由于肝癌细胞微囊泡PKM2诱导分化的巨噬细胞能够大量分泌各种细胞因子和趋化因子到培养液上清中，研究者将这些培养液上清与肝癌细胞共孵育后发现肝癌细胞的增殖和迁移能力明显提高，强烈提示巨噬细胞分泌的细胞因子/趋化因子能够对肿瘤细胞进行“反哺”进而促进肝癌进程。研究者随后利用小鼠肝癌原位移植瘤模型、皮下移植瘤模型、尾静脉注射肺转移模型、DEN/CCl4诱导的小鼠肝癌模型及Mst1/2 DKO小鼠自发产生肝癌等五种模型，提供一系列体内证据充分证明了肝癌细胞微囊泡PKM2通过介导肝癌细胞与单核/巨噬细胞间相互作用促进肝癌进程。

那么，肝癌细胞中的PKM2是如何被分选到微囊泡呢？研究表明，在肝癌细胞中PKM2发生了SUMO化修饰，促进其自身靶向质膜，通过与定位于质膜介导微囊泡出芽的蛋白ARRDC1相互作用，以微囊泡的形式外泌。研究者进而确定了PKM2分子上存在的3个潜在SUMO相互作用基序（SIM），其中，SIM IKII265-268介导PKM2的SUMO化修饰，并参与调控其外泌及后续介导肝癌细胞与单核/巨噬细胞间的互作过程。因此，PKM2I267&268A突变体可以作为一个理想的功能缺失突变体用于研究PKM2 SUMO化的修饰。此外，研究者还利用PKM2-SUMO1融合蛋白进一步证明了PKM2 SUMO化修饰所产生的下游生物学功能。

研究者继续探讨微囊泡PKM2诱导分化的巨噬细胞分泌的细胞因子是否以反馈调控加强肝癌细胞中PKM2的外泌？结果显示，巨噬细胞分泌的趋化因子CCL1能够与肝癌细胞表面受体CCR8结合，诱导信号级联反应，增强肝癌细胞中PKM2与ARRDC1相互作用，从而促进肝癌细胞中更多的PKM2以微囊泡的形式外泌，最终在肝癌细胞与单核/巨噬细胞间形成一个正反馈调节回路促进肝癌进程。

最后，研究者在DEN/CCl4或HFD/STZ诱导的小鼠肝癌模型及临床肝癌样品中发现在血浆中能够容易地检测到微囊泡PKM2，并且临床肝癌样品中血浆微囊泡PKM2水平明显提高，有望成为一个潜在的肝癌早期诊断标志物。

综上所述，该研究阐明了微囊泡介导肝癌细胞与单核/巨噬细胞间通讯促进肝癌进程的新通路，揭示了肝癌细胞微囊泡PKM2对单核/巨噬细胞分化的调控机制，并发现了CCL1-CCR8轴介导肝癌细胞与单核/巨噬细胞间形成正反馈调节回路。该研究为靶向肿瘤微环境治疗肝癌提供了新靶点和新策略，同时也为肝癌的临床早期诊断提供了有前景的标志物。

吴乔教授为该论文的通讯作者。侯佩佩（博士后）、罗立娟（硕士生）、陈航姿（教授）、陈旗涛（博士生）和边学利（博士生）为该论文的共同第一作者。该项工作得到了厦门大学附属中山医院王效民教授团队和生科院周大旺教授课题组的大力支持。