如果穿梭载体采用pLD53.SC-AEB质粒，此方案能用于表达报道基因，其表达受到选定的基因启动子的调控。本方案中，BAC转基因载体的基本起始要素包括一个BAC克隆和一个穿梭载体，在穿梭载体中插入了一个修饰盒和同源臂。

方案1~3介绍了BAC克隆的选择和小量与大量制备的分离方法，及其随后的评估。一种改进的穿梭载体pLD53，由于能采用传统的克隆方法，便于其操作，并且它不能在BAC宿主细胞中自由复制，被用于BAC工程。

R6ky复制起点保证了此载体只能在表达π复制蛋白的大肠杆菌菌株中复制(Metcalfet al.1996)。因为BAC宿主菌(DH10B)不表达此蛋白，pLD53不能在这些细胞中自由复制。

如我们在前面部分的讨论，穿梭载体也携带recA基因(用于恢复BAC宿主的重组能力)和sacB基因(用于穿梭载体的负筛选)。为了使BAC克隆和穿梭载体间发生同源重组，BAC 同源臂被克隆到穿梭载体中。

选定了一个携带目的基因的BAC后，接下来扩增两个约700bp的同源臂，并将它们克隆到穿梭载体中(见信息栏“同源臂、共合体和重组体的引物设计”)。然后，携带一个报道基因或目的突变的修饰盒被插入A和B同源臂之间。

在BAC修饰后，报道基因或目的突变被引入到选定的BAC克隆。在穿梭载体和BAC克隆的首次重组之后，只有含有目的共合体的载体能在选择条件下主存(氨苄青霉素和氯霉素中生长)。