在所有非小細胞肺癌（NSCLC）中，MET 14 號外顯子跳躍突變（exon 14 skipping，exon14Δ）率爲 3% ~ 4%，而在惡性程度高、預後極差的肺肉瘤樣癌（pulmonary sarcomatoid carcinoma，PSC）中，其突變率更是高達 4.9% ~ 31.8%[1]。今年 ASCO 年會上，報道了多項 MET 抑制劑在該突變陽性的 NSCLC 患者中的療效與安全性研究結果。

MET 14 號外顯子跳躍突變可能是一種獨立的致癌驅動基因

MET 14 號外顯子編碼的近膜結構域是 MET 的關鍵負性調控區。在一些患者體內，在 MET 基因 14 號外顯子上游端和下游端的剪接位點發生着多種影響剪接供體及受體位點的突變，這些突變可能導致前 mRNA 的剪接過程中 14 號外顯子隨其兩端的內含子一同被剪接致 MET 14 號外顯子缺失。而這一負性調控區域缺失將導致 c-MET 蛋白泛素化和降解降低，引起下游信號的持續激活（ 圖 1），最終成爲致癌因子，導致腫瘤發生 [2]。

圖 1. MET 14 號外顯子跳躍突變的發生機制示意圖 [2]

一些研究表明，MET 14 號外顯子跳躍突變可能是一種獨立的致癌驅動基因，且這一突變也是一項獨立的預後不良指標[2]。但是，長期以來，MET 14 號外顯子跳躍突變的檢測率較低，CSCO 指南目前也暫無針對該突變的相關診療推薦，國內很多具有這類突變、但其他常見驅動基因突變陰性的患者會被按照野生型進行治療，這類患者接受基因野生型治療的效果非常有限。國內目前在研的針對 MET 基因的靶向藥讓他們看到了希望，但急需精準、高效、便捷的檢測方法對潛在的受益者進行篩選。

精準檢測 MET 14 號外顯子跳躍突變存在諸多難點

對於 MET 14 號外顯子跳躍突變的檢測存在諸多挑戰。

●檢出率差異大：目前不同研究報道的對此類突變檢出率差異很大，臨牀醫生需要敏感可靠的檢測方法；

●發生位置多樣化：MET 14 號外顯子跳躍突變的發生位置多樣化，可在 MET 14 號外顯子與內含子間的交界處或位於其側翼的內含子內（圖 2）；

●具有分子多樣性：包括不等長度的鹼基對缺失、點突變和插入缺失突變等。

因此，檢測 MET 14 號外顯子跳躍突變需要特定的方法。

圖 2. MET 14 號外顯子周圍剪接位點的突變類型示意圖

MET 14 號外顯子跳躍突變的現有檢測手段

現有的用於檢測 MET 14 號外顯子跳躍突變的方法主要包括 c-MET 免疫組化染色、實時定量逆轉錄 PCR 後測序、直接針對 DNA 的 Sanger 測序以及下一代測序（next-generation sequencing，NGS，又稱高通量測序）。

其中，c-MET 免疫組化染色由於需要較多臨牀標本，且其用於檢測 MET 14 號外顯子跳躍突變的特異度較低，故臨牀較少應用；如今較常應用的 MET 14 號外顯子跳躍突變檢測手段主要有 Sanger 測序、RT-qPCR 法、以及基於 DNA 或 RNA 的 NGS。

DNA 一代測序（Sanger 法）——特異性 100%，但假陰性率較高

1977 年 DNA 層面的直接 Sanger 測序就已問世，其原理是首先對抽提的 DNA PCR 擴增得到 100 ng 左右的基因組 DNA，再對 PCR 產物使用每個正向或反向引物全面地對 14 號外顯子及其附近序列進行測序。DNA Sanger 測序無假陽性結果（特異性 100%），但假陰性率相對較高，有研究發現由於 Sanger 測序本身的侷限性，在 14 號外顯子區域發生大段缺失突變或 DNA 測序讀長過短的患者中無法檢測到 MET 14 號外顯子跳躍突變，而 NGS 則可探測到這類患者的突變。因此，考慮到檢測的敏感性，需要更合適的檢測這一突變的手段。

RT-PCR/RT-qPCR——準確快速，但臨牀應用缺乏質量控制標準

基於 mRNA 層面上的檢測主要有逆轉錄 PCR（RT-PCR）後測序，或臨牀上相對使用比較成熟的實時定量逆轉錄 PCR（RT-qPCR）的方法。

逆轉錄 PCR 後測序法首先以 mRNA 爲模板，在逆轉錄酶的催化下采用 MET 13 號外顯子的正向引物、MET 15 號外顯子的反向引物引導下合成互補的 DNA（cDNA），再使 PCR 拷貝 cDNA 片段後進行 Sanger 測序；RT-qPCR 法則是採用特異性的實時定量逆轉錄試劑盒在逆轉錄之後通過實時熒光定量 PCR 檢測 MET 14 號外顯子缺失的 MET RNA 轉錄本，一般 Ct（循環至閾值）值 < 33 被認爲是 MET 14 號外顯子缺失的 mRNA 陽性，而 Ct 值 ≥ 34 爲陰性 [3]。

然而，上述兩種方法均以檢測缺失 MET 14 號外顯子的 mRNA 爲原理，RT-PCR 後測序法步驟繁瑣；而 RT-qPCR 法雖然能夠較準確快速地探測到 MET 14 號外顯子跳躍突變的存在，但目前臨牀應用缺乏質量控制標準，例如試劑、流程的標準化，以及陽性截斷值的統一標準，上文所述的通過 Ct 值判斷 MET14 號外顯子缺失的陽性標準也僅爲參考，不同研究採取的標準不盡相同 [3]，因此基於 mRNA 層面的方法尚未獲得相關指南及共識的推薦。

NGS——所需樣本量少，高敏感性，可定量分析

NGS 技術分爲基於 RNA 的轉錄組測序（RNA-Seq）及基於 DNA 的雜交捕獲的大規模靶向測序 panel（DNA-Seq）或全外顯子測序（WES）。

基於 DNA 的 NGS 技術主要是大規模靶向測序 panel 和報道較少的 WES。常用的 NGS panel 檢測特異性突變的步驟主要包括 DNA 的提取和總 DNA 文庫的構建、定製基因 panel、文庫測序和雜交捕獲篩選。 此技術可在 DNA 層面上直接鑑定出 MET 14 號外顯子區域鹼基對突變的具體情況，目前是用於檢測 MET 14 號外顯子跳躍突變最常用的手段。

然而，目前市售的 DNA NGS panel 最多隻能檢測到 63% 的已知 MET 14 號外顯子跳躍突變 [4]，部分尚未報告的突變可能並不包含於 panel 中，卻依然能引起 MET 14 號外顯子錯誤剪接和跳躍突變，造成 DNA-Seq 檢測結果的假陰性。

NGS 在國內外的應用現狀及痛點

目前在中國，僅有 NGS 得到了 2019 版 CSCO 指南用於檢測 MET 14 號外顯子跳躍突變方法的推薦，且 DNA NGS panel 也已經在臨牀用於檢測患者包括 MET 14 號外顯子跳躍突變在內的多種驅動基因改變，尤其是在接受二線靶向治療的患者中利用外周血遊離 DNA 標本的檢測 [5]。但 NGS 面臨着實際應用中成本較高、缺乏可靠且統一的臨界值標準、中國市場仍無足夠靶向治療藥物等限制了 NGS 在 MET 檢測上的應用，另外在國內也缺乏對比使用外周血標本及組織學標本檢測結果之間一致性的相關研究數據。

而在國外，隨同選擇性 MET 抑制劑一同獲批的還有用於檢測 MET 14 號外顯子跳躍突變的伴隨診斷工具（ArcherMET 和 FoundationOne CDx）。這些診斷工具均基於 NGS 原理，利用錨定多重 PCR 技術創建基因組文庫從而探測液體活檢（即血液 ctDNA）和組織樣本（RNA）來源的 MET 14 號外顯子跳躍突變。

最新研究 [6]發現，液體活檢和組織樣本兩種檢測方法分別陽性的患者對於 MET 靶向治療的療效反應相似（48% vs 50%），且兩種方法共同陽性的患者（n=27）分別佔單一方法陽性的比例也相似（41% vs 45%），提示這兩種方法都可作爲這一突變的 NGS 檢測手段。然而，目前尚缺乏直接對比基於 ctDNA 或組織 RNA 的 NGS 敏感度、特異性的研究。

小 結

現有用於檢測 MET 14 號外顯子跳躍突變的方法中，DNA 一代測序假陰性率較高；RT-qPCR 及 NGS 是目前臨牀應用較多的方法，而 NGS 是目前唯一獲得指南推薦的 MET 14 號外顯子跳躍突變的檢測方法。但成本較高、缺乏可靠統一臨界值標準等因素限制了 NGS 檢測 MET 14 號外顯子跳躍突變的進一步應用。

精準定位才能精準打擊，相信隨着檢測技術的發展，具有 MET 14 號外顯子跳躍突變的患者將不再與靶向治療「擦肩而過」。

參考文獻

1. Paik PK, et al. Response to MET inhibitors in patients with stage IV lung adenocarcinomas harboring MET mutations causing exon 14 skipping. Cancer Discov. 2015;5(8):842-849.

2.Awad MM. Impaired c-Met Receptor Degradation Mediated by MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer. J Clin Oncol. 2016;34(8): 879-881.

4. Poirot B, et al. MET Exon 14 Alterations and New Resistance Mutations to Tyrosine Kinase Inhibitors: Risk of Inadequate Detection with Current Amplicon-Based NGS Panels. J Thorac Oncol. 2017;12(10):1582-1587.

5. 中國臨牀腫瘤學會指南工作委員會. 中國臨牀腫瘤學會(CSCO)原發性肺癌診療指南-2019-Primary lung cancer. 人民衛生出版社. 2019.

CN-60076

題圖來源丨站酷海洛

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