在所有非小细胞肺癌（NSCLC）中，MET 14 号外显子跳跃突变（exon 14 skipping，exon14Δ）率为 3% ~ 4%，而在恶性程度高、预后极差的肺肉瘤样癌（pulmonary sarcomatoid carcinoma，PSC）中，其突变率更是高达 4.9% ~ 31.8%[1]。今年 ASCO 年会上，报道了多项 MET 抑制剂在该突变阳性的 NSCLC 患者中的疗效与安全性研究结果。

MET 14 号外显子跳跃突变可能是一种独立的致癌驱动基因

MET 14 号外显子编码的近膜结构域是 MET 的关键负性调控区。在一些患者体内，在 MET 基因 14 号外显子上游端和下游端的剪接位点发生着多种影响剪接供体及受体位点的突变，这些突变可能导致前 mRNA 的剪接过程中 14 号外显子随其两端的内含子一同被剪接致 MET 14 号外显子缺失。而这一负性调控区域缺失将导致 c-MET 蛋白泛素化和降解降低，引起下游信号的持续激活（ 图 1），最终成为致癌因子，导致肿瘤发生 [2]。

图 1. MET 14 号外显子跳跃突变的发生机制示意图 [2]

一些研究表明，MET 14 号外显子跳跃突变可能是一种独立的致癌驱动基因，且这一突变也是一项独立的预后不良指标[2]。但是，长期以来，MET 14 号外显子跳跃突变的检测率较低，CSCO 指南目前也暂无针对该突变的相关诊疗推荐，国内很多具有这类突变、但其他常见驱动基因突变阴性的患者会被按照野生型进行治疗，这类患者接受基因野生型治疗的效果非常有限。国内目前在研的针对 MET 基因的靶向药让他们看到了希望，但急需精准、高效、便捷的检测方法对潜在的受益者进行筛选。

精准检测 MET 14 号外显子跳跃突变存在诸多难点

对于 MET 14 号外显子跳跃突变的检测存在诸多挑战。

●检出率差异大：目前不同研究报道的对此类突变检出率差异很大，临床医生需要敏感可靠的检测方法；

●发生位置多样化：MET 14 号外显子跳跃突变的发生位置多样化，可在 MET 14 号外显子与内含子间的交界处或位于其侧翼的内含子内（图 2）；

●具有分子多样性：包括不等长度的碱基对缺失、点突变和插入缺失突变等。

因此，检测 MET 14 号外显子跳跃突变需要特定的方法。

图 2. MET 14 号外显子周围剪接位点的突变类型示意图

MET 14 号外显子跳跃突变的现有检测手段

现有的用于检测 MET 14 号外显子跳跃突变的方法主要包括 c-MET 免疫组化染色、实时定量逆转录 PCR 后测序、直接针对 DNA 的 Sanger 测序以及下一代测序（next-generation sequencing，NGS，又称高通量测序）。

其中，c-MET 免疫组化染色由于需要较多临床标本，且其用于检测 MET 14 号外显子跳跃突变的特异度较低，故临床较少应用；如今较常应用的 MET 14 号外显子跳跃突变检测手段主要有 Sanger 测序、RT-qPCR 法、以及基于 DNA 或 RNA 的 NGS。

DNA 一代测序（Sanger 法）——特异性 100%，但假阴性率较高

1977 年 DNA 层面的直接 Sanger 测序就已问世，其原理是首先对抽提的 DNA PCR 扩增得到 100 ng 左右的基因组 DNA，再对 PCR 产物使用每个正向或反向引物全面地对 14 号外显子及其附近序列进行测序。DNA Sanger 测序无假阳性结果（特异性 100%），但假阴性率相对较高，有研究发现由于 Sanger 测序本身的局限性，在 14 号外显子区域发生大段缺失突变或 DNA 测序读长过短的患者中无法检测到 MET 14 号外显子跳跃突变，而 NGS 则可探测到这类患者的突变。因此，考虑到检测的敏感性，需要更合适的检测这一突变的手段。

RT-PCR/RT-qPCR——准确快速，但临床应用缺乏质量控制标准

基于 mRNA 层面上的检测主要有逆转录 PCR（RT-PCR）后测序，或临床上相对使用比较成熟的实时定量逆转录 PCR（RT-qPCR）的方法。

逆转录 PCR 后测序法首先以 mRNA 为模板，在逆转录酶的催化下采用 MET 13 号外显子的正向引物、MET 15 号外显子的反向引物引导下合成互补的 DNA（cDNA），再使 PCR 拷贝 cDNA 片段后进行 Sanger 测序；RT-qPCR 法则是采用特异性的实时定量逆转录试剂盒在逆转录之后通过实时荧光定量 PCR 检测 MET 14 号外显子缺失的 MET RNA 转录本，一般 Ct（循环至阈值）值 < 33 被认为是 MET 14 号外显子缺失的 mRNA 阳性，而 Ct 值 ≥ 34 为阴性 [3]。

然而，上述两种方法均以检测缺失 MET 14 号外显子的 mRNA 为原理，RT-PCR 后测序法步骤繁琐；而 RT-qPCR 法虽然能够较准确快速地探测到 MET 14 号外显子跳跃突变的存在，但目前临床应用缺乏质量控制标准，例如试剂、流程的标准化，以及阳性截断值的统一标准，上文所述的通过 Ct 值判断 MET14 号外显子缺失的阳性标准也仅为参考，不同研究采取的标准不尽相同 [3]，因此基于 mRNA 层面的方法尚未获得相关指南及共识的推荐。

NGS——所需样本量少，高敏感性，可定量分析

NGS 技术分为基于 RNA 的转录组测序（RNA-Seq）及基于 DNA 的杂交捕获的大规模靶向测序 panel（DNA-Seq）或全外显子测序（WES）。

基于 DNA 的 NGS 技术主要是大规模靶向测序 panel 和报道较少的 WES。常用的 NGS panel 检测特异性突变的步骤主要包括 DNA 的提取和总 DNA 文库的构建、定制基因 panel、文库测序和杂交捕获筛选。 此技术可在 DNA 层面上直接鉴定出 MET 14 号外显子区域碱基对突变的具体情况，目前是用于检测 MET 14 号外显子跳跃突变最常用的手段。

然而，目前市售的 DNA NGS panel 最多只能检测到 63% 的已知 MET 14 号外显子跳跃突变 [4]，部分尚未报告的突变可能并不包含于 panel 中，却依然能引起 MET 14 号外显子错误剪接和跳跃突变，造成 DNA-Seq 检测结果的假阴性。

NGS 在国内外的应用现状及痛点

目前在中国，仅有 NGS 得到了 2019 版 CSCO 指南用于检测 MET 14 号外显子跳跃突变方法的推荐，且 DNA NGS panel 也已经在临床用于检测患者包括 MET 14 号外显子跳跃突变在内的多种驱动基因改变，尤其是在接受二线靶向治疗的患者中利用外周血游离 DNA 标本的检测 [5]。但 NGS 面临着实际应用中成本较高、缺乏可靠且统一的临界值标准、中国市场仍无足够靶向治疗药物等限制了 NGS 在 MET 检测上的应用，另外在国内也缺乏对比使用外周血标本及组织学标本检测结果之间一致性的相关研究数据。

而在国外，随同选择性 MET 抑制剂一同获批的还有用于检测 MET 14 号外显子跳跃突变的伴随诊断工具（ArcherMET 和 FoundationOne CDx）。这些诊断工具均基于 NGS 原理，利用锚定多重 PCR 技术创建基因组文库从而探测液体活检（即血液 ctDNA）和组织样本（RNA）来源的 MET 14 号外显子跳跃突变。

最新研究 [6]发现，液体活检和组织样本两种检测方法分别阳性的患者对于 MET 靶向治疗的疗效反应相似（48% vs 50%），且两种方法共同阳性的患者（n=27）分别占单一方法阳性的比例也相似（41% vs 45%），提示这两种方法都可作为这一突变的 NGS 检测手段。然而，目前尚缺乏直接对比基于 ctDNA 或组织 RNA 的 NGS 敏感度、特异性的研究。

小 结

现有用于检测 MET 14 号外显子跳跃突变的方法中，DNA 一代测序假阴性率较高；RT-qPCR 及 NGS 是目前临床应用较多的方法，而 NGS 是目前唯一获得指南推荐的 MET 14 号外显子跳跃突变的检测方法。但成本较高、缺乏可靠统一临界值标准等因素限制了 NGS 检测 MET 14 号外显子跳跃突变的进一步应用。

精准定位才能精准打击，相信随着检测技术的发展，具有 MET 14 号外显子跳跃突变的患者将不再与靶向治疗「擦肩而过」。

参考文献

1. Paik PK, et al. Response to MET inhibitors in patients with stage IV lung adenocarcinomas harboring MET mutations causing exon 14 skipping. Cancer Discov. 2015;5(8):842-849.

2.Awad MM. Impaired c-Met Receptor Degradation Mediated by MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer. J Clin Oncol. 2016;34(8): 879-881.

4. Poirot B, et al. MET Exon 14 Alterations and New Resistance Mutations to Tyrosine Kinase Inhibitors: Risk of Inadequate Detection with Current Amplicon-Based NGS Panels. J Thorac Oncol. 2017;12(10):1582-1587.

5. 中国临床肿瘤学会指南工作委员会. 中国临床肿瘤学会(CSCO)原发性肺癌诊疗指南-2019-Primary lung cancer. 人民卫生出版社. 2019.

CN-60076

题图来源丨站酷海洛

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