從臨牀的腫瘤診療從放、化療時代過渡到靶向、免疫治療時代開始，按照生物標記物劃分腫瘤類型，逐漸成爲一種與傳統的按原發器官分類並行的腫瘤區分方式。在越來越多的腫瘤新藥適應症裏，已經不會簡單羅列*期*癌，而是出現瞭如EGFR基因突變的III期肺癌、HER2基因突變的III期乳腺癌等字樣。

2017年，FDA批准帕博利珠單抗用於治療 dMMR/MSI-H 型不可切除或轉移性經治的實體瘤患者。這是全球首個直接根據生物標記物劃定適應症的泛癌種腫瘤藥物，讓微衛星不穩定（MSI）這一熱門的腫瘤免疫標記物得到了監管層的官方認證。

微衛星，即人類基因組中的短串聯重複序列（STR），包括單核苷酸的重複、雙核苷酸的重複，甚至更多核苷酸的重複。微衛星遍佈人類基因組中，目前知道的微衛星已經達到1900萬個左右。

基因組中的微衛星示意圖

1997年，美國國家腫瘤研究所（NCI）首次對MSI進行了定義。與正常組織相比，腫瘤組織中由微衛星重複單元的插入或缺失所導致的微衛星長度的改變，稱爲微衛星不穩定，是腫瘤中常見的第5種突變類型，MSI-H腫瘤即指具有微衛星高度不穩定表型的腫瘤。

據統計，2015年，中國有約450萬癌症新發病例。對於被檢測爲MSI-H的患者，其適用的腫瘤治療方案往往與沒有發生這類突變的患者不同，因此，國內越來越多的基因檢測公司開始爲腫瘤患者提供MSI檢測服務，但一直沒有監管批准的MSI檢測產品上市。

這種狀況持續到2021年。1月下旬，國家藥品監督管理局（NMPA）批准了桐樹基因申請的“微衛星不穩定（MSI）檢測試劑盒（多重熒光PCR-毛細管電泳法）”，該試劑盒是國內首個獲得NMPA批准的微衛星不穩定檢測試劑盒，在臨牀上爲醫生制定個體化診療方案提供參考依據。成立4年，桐樹基因擒獲MSI檢測首證，背後是一條怎樣的註冊報批之路？首證落地，MSI檢測和腫瘤精準醫療將發生如何變革？近日，動脈網對桐樹基因創始人嚴令華進行了專訪，嘗試解答這些問題。

MSI-H人羣疾病負荷大，臨牀病理特徵獨特

我們談及腫瘤基因突變，通常是指點突變、插入/缺失、融合和擴增。這類基因突變往往造成某一兩個基因功能異常，從而引發其所在的通路信號傳遞異常，惡性腫瘤就在這個過程中發生、發展。MSI-H腫瘤也有相似的產生邏輯，但更爲複雜。

處於編碼區的MSI導致移碼突變，會觸發相關基因功能失活，由於微衛星數量龐大且遍佈整個基因組，因此位於多個基因上的微衛星不穩定將會導致與腫瘤相關的多個信號通路中的多個基因功能異常，進而導致MSI-H腫瘤的發生發展。

MSI-H 的表型最早是在遺傳性結直腸癌中被發現，但後來的研究發現，MSI-H 腫瘤發生於多個部位中，最常見的發生部位爲結直腸、子宮內膜和胃，同時也發生於其他部位。

各個癌種的MSI-H患者比例

如果根據各個癌種MSI-H的發生率估算，每年新發MSI-H腫瘤患者達到30多萬，這個數字與每年新發乳腺癌病例數相當，遠高於前列腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌、淋巴瘤等其他高發腫瘤。與此同時，不同MSI-H腫瘤患者在臨牀病理、分子病理方面往往具有相似的特徵。

MSI-H腫瘤與其他癌種年新發病理數比較 數據來源：JCO Precis Oncol

例如，有研究表明，MSI多發生在II期結直腸癌、近端結腸，並且MSI-H型腫瘤具有分化較差、伴有粘液成分、淋巴管血管、T細胞浸潤等臨牀病理上的特徵。同時，MSI-H腫瘤是具有分子共性的，研究表明，MSI的現象多見於KRAS野生型、BRAF突變型、PIK3CA突變型，TMB-H的患者中，且特定的通路MMR、WNT、PI3K和NOTCH的基因突變在MSI-H腫瘤中存在富集現象，這與腫瘤起源的部位是無關的。也就是說，MSI-H腫瘤是一類獨特的腫瘤，擁有一套獨有的分子發生機制，並具備特殊的臨牀/分子病理特徵。

由此可見，以MSI作爲區分腫瘤類型的生物標誌物，一方面能夠找出數量龐大的同類型患者，這些患者具有差異化的腫瘤治療需求；另一方面，帶有MSI-H生物標誌物特徵的腫瘤患者，通常具有相似臨牀病理、分子病理特徵，可以幫助臨牀醫生制定、優化針對MSI-H型腫瘤患者的完整治療方案。這也是MSI檢測的臨牀價值日益受到重視的底層邏輯。

MSI檢測的4大臨牀價值

MSI檢測最早被用在林奇綜合徵的篩查中。林奇綜合徵曾被稱作遺傳性非息肉病性結直腸癌（(Hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC)，是遺傳性腫瘤中發生率最高的一類。MSI 檢測可以作爲林奇綜合徵的初篩手段，對於確定爲MSI-H 的患者，則採用林奇綜合徵致病基因MMR的胚系突變檢測，來明確診斷。

此外，MSI檢測在臨牀上被廣泛應用在結直腸癌、胃癌等腫瘤的預後判斷和輔助化療療效預測中，篩選出需要在手術後接受進一步化療的患者。

近年來，MSI檢測最熱門的一項應用，便是腫瘤免疫治療的響應預測。

丁香園在《微衛星不穩定百科全書》中介紹，微衛星不穩定會產生大量的移碼突變（Frameshift mutation），導致閱讀框變化，造成下游的一系列密碼子改變，產生完全不同的肽鏈，也被稱爲“移碼肽”（Frameshift peptides，FSP）。這些移碼肽作爲新抗原，具有高度的免疫原性，引起腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）的免疫應答，由此可見，這也是 MSI-H 腫瘤對免疫治療敏感的原因之一。其次，MSI-H腫瘤通常伴有高腫瘤突變負荷（Tumor Mutation Burden，TMB），而高TMB也是免疫治療敏感的標誌之一。

2015年的一項臨牀研究首次證明，MSI-H 型的結直腸癌患者能夠從帕博利珠單抗的治療中獲益。後續的多項臨牀研究更是將能夠響應免疫治療的MSI-H患者拓展到超過10種腫瘤。換言之，MSI檢測被證明是一種泛癌種的腫瘤免疫響應預測手段。

到2020年，最新公佈的KEYNOTE-177 研究結果顯示，相較於化療，帕博利珠單抗作爲 MSI-H轉移性結直腸癌的一線治療方案具有臨牀意義和統計學意義。這一研究結果，進一步擴大MSI檢測在腫瘤免疫響應預測中的應用範圍。在美國國立綜合癌症網絡（NCCN）的結直腸癌診療指南中，已經把MSI檢測作爲選擇一線治療方案的必要程序，並在超過10種腫瘤中，推薦採用MSI檢測進行免疫響應預測。

主要癌種的MSI臨牀應用場景數據

嚴令華指出，理論上，所有確診的結直腸癌患者、確診的胃癌患者、確診的子宮內膜癌患者、確診的小腸腺癌患者、需進行林奇綜合徵篩查的腫瘤患者、尋求免疫治療的所有實體瘤患者，都有必要做MSI檢測。其中，早期患者主要採用MSI檢測進行預後判斷、林奇綜合徵篩查和輔助化療，晚期患者則主要用MSI檢測來做免疫響應預測。“

前期，由於沒有註冊的產品上市，MSI檢測主要通過LDT（臨牀實驗室自建項目）的方式來完成，全國每年只能做到10萬例左右。嚴令華告訴動脈網，“這對於30萬MSI-H患者的覆蓋十分有限，我們預計臨牀MSI檢測的需求每年有150萬例。”

合理的MSI檢測，微衛星位點檢測Panel的選擇是關鍵

在 MSI 診斷中，檢測位點（Panel）的設置，往往決定了檢測結果的假陽性率或者假陰性率。國際上權威的MSI檢測Panel有兩個，一個是NCI Panel，由 2 個單核苷酸位點（BAT-25 和 BAT-26）和 3 個雙核苷酸位點（D2S123、D5S346 和 D17S250）組成，也就是著名的2B3D Panel。另一個是Pentaplex Panel，包括5 個單核苷酸微衛星位點，BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22和NR-24。

桐樹基因從2016年末開始聯合國內頭部的腫瘤學科專家，開展MSI相關的臨牀研究，已經積累下超過2萬例MSI檢測患者數據，發表近30篇學術論文。在嚴令華看來，這些研究成果最核心的意義在於，驗證了2B3D Panel在中國人羣MSI檢測中的有效性，爲更多MSI檢測產品設計提供循證依據。

“儘管2B3D是許多國際指南認定的權威Panel，但支撐這些共識的都是基於歐美人羣的研究數據，中國人羣的遺傳性特徵是不一樣的。”嚴令華指出，“桐樹基因用了3項臨牀研究來回答中國人羣應該採用哪種MSI檢測Panel的問題。”3項臨牀研究分別是，NCI Panel與Promega Panel的頭對頭比較分析；NCI Panel、Promega Panel與24個位點Panel的對比研究；MSI檢測與顯微切割對比的腫瘤異質性研究。

臨牀研究表明，中國人羣的NCI Panel敏感性相比Promega Panel高18%，24位點Panel的敏感性最低。也就是說，MSI檢測的位點選擇並不是越多越好，而是要選擇經過驗證的位點，從而提升檢出率。桐樹基因的第三項臨牀研究表明，MSI檢測幾乎不受腫瘤異質性影響，驗證了MSI檢測可以提供更高質量的臨牀證據。

對於桐樹基因MSI檢測的Panel設定，嚴令華的把關或許有點嚴苛。經過大規模的臨牀檢驗後，嚴令華才最終敲定開發基於2B3D NCI Panel的MSI檢測試劑，在這期間，桐樹基因沒有向患者開放商業化的MSI檢測服務，堅持臨牀研究的客觀性。“Panel選擇是MSI檢測開發的關鍵，這個環節出現問題，就很難保證產品品質。”嚴令華強調。

目前，《中國臨牀腫瘤學會（CSCO）結直腸癌診療指南 2020 版》、《結直腸癌分子標誌物專家共識》（2018 版）、《遺傳性結直腸癌臨牀診治和家系管理中國專家共識》（2018 版）及《ESMO 共識：腫瘤免疫治療中的微衛星不穩定檢測建議及其與 PD-1/PD-L1 表達和腫瘤突變負荷的關係》（2019 版）等多個國內外指南和共識，都推薦用2B3D NCI Panel進行MSI檢測。

據瞭解，桐樹基因抽調了科研、醫學、產品等部門的近20人團隊，專門從事MSI檢測臨牀研究。除了前述3項關鍵的Panel研究外，桐樹基因還開展了覆蓋約3000名MSI-H患者的腫瘤發生率研究，探索結直腸癌、胃癌、子宮內膜癌、肝癌、腦膠質瘤等癌種患者的MSI-H比率。MSI-H患者的腫瘤發生率研究是一個冷門領域，但卻爲指導臨牀腫瘤精準醫療提供了重要的參考。此外，桐樹基因佈局了MSI-H患者的PD-1用藥前瞻性臨牀研究。從已經入組的患者治療情況看，MSI檢測與PD-1療效具有明確的相關性。

用“120分”的產品去申報註冊

嚴令華坦言，從成立桐樹基因之初，他想做的就是合規的檢測產品。在嚴令華看來，IVD企業應該定位於爲醫生提供好用的檢測工具，只有服務好了醫生，才能最終造福患者。MSI檢測是其中一個方向。

桐樹基因開發MSI檢測產品的初心，與嚴令華父親的患癌經歷不無關係。10多年前，嚴令華的父親被診斷出患有晚期胃癌。在手術後的6段輔助化療剛剛進行到第2段時，父親不良反應非常嚴重。嚴令華敏銳地意識到，父親可能是MSI-H患者，接受輔助化療的效果可能並不好。後來的檢測驗證了嚴令華的猜測，父親於是停止了輔助化療，現在的健康狀況依然很好。“當時，我確信，MSI檢測是真的是廣大胃腸腫瘤患者所需要的，”嚴令華說，“我們的目標是讓每位需要做MSI檢測的患者接受合格的MSI檢測。”

所以在選定2B3D NCI Panel、啓動相關驗證之後，桐樹基因也第一時間與監管層、臨牀專家溝通，要證明在大規模的臨牀應用中，試劑盒的準確率可以達到99%，甚至100%。“嚴令華表示，”這就意味着，從研發階段開始，就要做出100分，乃至120分的產品，否則到註冊檢驗階段註定會失敗。“

桐樹基因提交的註冊申報材料中包含1000餘例患者臨牀試驗數據，但是早期的引物選擇、方法學驗證則實施了上萬例的MSI檢測。根據監管層的要求，桐樹基因採用多種對照方法對MSI檢測試劑盒進行了驗證，包括一代測序、IHC（免疫組化）、NGS（二代測序）。

在臨牀實踐中，除了PCR+毛細管電泳的金標準方法可以評估MSI狀態，IHC也常用於MMR蛋白的檢測，間接反映MSI的狀態。

MSI 狀態由 MMR 蛋白功能異常導致，IHC法的原理通過對 MMR 系統中 4 個主要的蛋白（MLH1、MSH2、MSH6 及 PMS2）表達的檢測來反映 MSI 的狀態。IHC 方法成本低、耗時少，在國內醫療機構病理科的普及性較高。有研究顯示，IHC 和PCR+毛細管電泳法的一致性可以達到 85% 以上。

不過，IHC 判讀識別對病理醫師要求很高，檢測結果容易受判讀人員的主觀因素影響，產生假陰性和假陽性。此外，IHC 檢測的一抗選擇對陽性和陰性的判斷至關重要，操作流程難以標準化和規範化，從而無法保證 IHC 結果的可重複性，影響檢測結果。因此，嚴令華認爲，將PCR+毛細管電泳法與IHC法相結合，是現有條件下更可靠的MSI檢測方式。

不同技術路徑的MSI檢測對比

近年來，隨着分子生物學發展和NGS測序成本的降低，全外顯子組測序和多基因靶向區域測序逐漸也應用於 MSI 的檢測中。NGS 通量大，靈敏度高，採用NGS Panel一次性可以檢測上千個 MSI 位點、MMR 基因狀態及其他分子標誌物。但在嚴令華看來，由於 NGS 數據分析更爲複雜，需要明確統一的算法及評判標準對 MSI 進行評估，而這種檢測方式進入臨牀應用，則需要更多中國人羣的數據積累和驗證。

MSI產品初步定型後，桐樹基因的臨牀試驗設計歷時近半年。這期間，他們反覆與行業內的專家溝通，用前期積累的研究數據一家一家敲定參與註冊臨牀試驗的醫療機構。

嚴令華告訴動脈網，他十分感謝桐樹基因MSI產品註冊申報的這段經歷，也從中學到了很多，“這個過程體現了所有人都本着爲患者負責的態度，我們就應該這樣去做。“

從10萬例到150萬例

接受動脈網專訪的時候，距離NMPA正式批准桐樹基因的MSI檢測產品上市已經過去了一週，嚴令華仍難掩激動。“這個產品獲批，必然會深刻改變MSI檢測市場，但是我認爲更重要的是，MSI-H患者距離更精準的臨牀治療方案又進了一步。”嚴令華說到，“首先是穩定性，把MSI檢測放到醫院內來做，肯定是更可靠的。其次是時效性，以往MSI檢測把樣本外送，集中檢測後傳回結果，中間需要4~5天，而院內的MSI檢測最快當天就能出結果。”

試劑盒上市後，MSI檢測也將在臨牀場景中發揮更大的價值。以腫瘤免疫響應預測爲例，按照國家衛健委要求，應選擇取得相關資質的檢測試劑來指導抗腫瘤藥物的使用。選擇免疫治療的腫瘤患者往往病情危重，藥物價格也較高，採用合規的MSI檢測，對醫生和患者都形成保護。

目前，桐樹基因已經整合了20人的商務團隊，在未來2~3年中，將MSI檢測試劑送到全國的醫療機構中。據嚴令華預測，國內能夠提供MSI檢測的醫療機構至少有200家，如果按照每家醫療機構每年完成1000~1500例MSI檢測計算，MSI檢測試劑將成爲腫瘤精準醫療領域年需求量最大的檢測單品。

從目前臨牀醫生溝通的結果看，MSI檢測臨牀需求非常強烈，只是遲遲沒有合規產品上市，很多醫院很難選擇。產品註冊證落地後，桐樹基因已經陸續接到了許多醫療機構的採購意向。“所以產品註冊證落地，會爲MSI檢測樣本量從10萬例提高到150萬例輸出強勁動力。”嚴令華推測，首證發出後，或有更多的MSI檢測試劑，將充分滿足臨牀對MSI檢測的需求。

對於桐樹基因而言，獲得MSI檢測產品註冊證，是精準醫療創新和探索的一個重要節點，但遠不是終點。嚴令華表示，接下來，在大力推動MSI檢測試劑快速覆蓋臨牀需求的同時，桐樹基因會在腫瘤精準醫療的另外兩個方向持續發力，爭取未來實現ctDNA和大Panel腫瘤NGS檢測的關鍵突破。

寫作參考：

丁香園：《微衛星不穩定百科全書》

腫瘤時間：微衛星不穩定-不能忽視的腫瘤指標

春雨醫生：結直腸癌微衛星不穩定性（MSI）檢測及其臨牀意義