摘要：基於定向進化，Arnold教授課題組發展了一系列能催化非天然C−H酰胺化的細胞色素P450酶，並且能夠精確控制同一個底物中不同位置C−H鍵的選擇性，從而合成手性α, β, γ內酰胺(圖2A)。2019年5月10日，Arnold教授課題組又一突破性工作發表在Science上，標題爲“Genetically Tunable Enzymatic C‒H Amidation for Lactam Synthesis”報道了P450催化的氮賓碳氫插入反應，高效高選擇性的合成了一系列高價值手性內酰胺化合物。

點評 | 雷曉光（北京大學化學與分子工程學院）

責編 | 兮

Coverimage, @Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Science

定向進化(directed evolution) 是在試管中模擬自然進化過程，通過快速突變和重組等方式人爲的產生基因多樣性，然後按照特定的需要和目的給予選擇壓力，篩選出具有期望特徵的蛋白質或者核酸。這一概念是在上世紀90年代由美國加州理工學院的化學/生物/工程學家Frances Arnold教授提出的，並廣泛運用於生物以及其交叉領域中，特別是酶工程領域。因其在 “酶的定向進化” 中的開創性貢獻，Frances Arnold教授獲得了2018年的諾貝爾化學獎。

近年來，Arnold教授課題組一系列經典工作正向人們展示着“酶的定向進化” 在生物催化領域的強大功能。其代表工作有：細胞色素c用於碳硅鍵的構築（Science2016，354，1048）和碳硼鍵的形成 (Nature2017, 552, 7683)，細胞色素P450用於烯烴的反馬氏氧化 (Science 2017, 358, 215) ，雙環丁烷的構建(Science. 2018, 360, 71)以及卡賓的碳氫插入反應 (Nature.2019, 565, 67)。

2019年5月10日，Arnold教授課題組又一突破性工作發表在Science上，標題爲“Genetically Tunable Enzymatic C‒H Amidation for Lactam Synthesis”報道了P450催化的氮賓碳氫插入反應，高效高選擇性的合成了一系列高價值手性內酰胺化合物。此工作展示了定向進化不僅能夠改造天然酶催化非天然化學反應，而且更能“跨界”挑戰化學合成的極限。博士生Inha Cho以及博士後賈知軍爲該工作的共同第一作者(圖1)。

圖1. 該工作作者合照. 從左至右：Inha Cho, Frances Arnold, Zhi-Jun Jia (賈知軍)

惰性C−H鍵的官能團化被認爲是化學的聖盃，根本性地改變着合成化學的邏輯設計。然而，C−H鍵具有較高的解離能，通常具有較高的熱力學穩定性和較低的化學反應性；另一方面C−H鍵廣泛存在有機化合物中，同一化合物中通常含有多個C−H鍵。因此，C−H鍵官能團化的位置選擇性是傳統化學合成中一個極大的難題。傳統化學催化主要依靠底物控制去活化特定的C−H鍵，包括使用含有導向基團的或者僅有一個相對活潑C−H鍵的底物。另一方面，雖然自然界中酶催化的生化反應具有極高的位置選擇性，但是自然界的酶催化的反應種類以及底物範圍都非常侷限，因而無法提供一個普適性的方法去解決非天然惰性C−H鍵官能團化的位置選擇性問題。

基於定向進化，Arnold教授課題組發展了一系列能催化非天然C−H酰胺化的細胞色素P450酶，並且能夠精確控制同一個底物中不同位置C−H鍵的選擇性，從而合成手性α, β, γ內酰胺(圖2A)。其中β內酰胺是抗生素的重要骨架。值得一提的是，僅僅6個突變(圖2B)就能將催化效率提高500倍至100萬TTN，即一分子P450酶可以催化產生100萬以上分子的β內酰胺產物。基於此酶催化方法底物適用廣泛，立體選擇性高，易放大生產且產物純化簡便(大部分產物直接過濾提純，圖2C)。目前此方法正在工業轉化中。

圖2. A. 反應總結. B.相關蛋白結構以及突變位點. C. 放大生產以及純化.

專家點評

雷曉光（北京大學化學與分子工程學院教授，北大-清華生命科學聯合中心高級研究員，主要從事天然產物合成，化學生物學，合成生物學與創新藥物研究）

惰性碳氫鍵（C-H）的官能團化是合成化學領域的重要研究方向，被認爲是合成化學的聖盃，它能夠在複雜的底物上直接構建出新的碳-碳鍵（C-C）以及碳-雜原子鍵(C-N,C-O, C-Si等)，爲簡潔高效地修飾以及改造化學分子提供了新的思路。由於複雜分子上往往具有多個惰性的C-H，能在底物衆多的C-H中實現選擇性地官能團化是有機合成化學家們夢寐以求的夢想。P450酶及其變種P411酶是一類含有血紅素（heme）的蛋白，他們能夠在複雜天然產物上選擇性地進行惰性C-H的氧化，是自然界長期進化過程中產生的一種高效的選擇性的C-H活化催化劑。近年來，通過蛋白工程技術對P450進行改造，不僅賦予了P450催化非天然反應的全新功能，還可以改變其反應位點，從而實現複雜底物上不同位點的可控C-H活化。

內酰胺（lactams）結構廣泛存在於藥物分子以及天然產物中，如何簡潔高效地合成內酰胺結構是合成化學家的一大難題。通過分子內的金屬氮卡賓直接對惰性C-H進行酰胺化是合成具有內酰胺結構分子的一種重要方法，但由於在該過程中原位生成的羰基氮卡賓中間體很容易生成異氰酸酯，從而無法有效進行C-H插入而形成內酰胺結構。2018年，Chang課題組在Science上首次報道了利用三價金屬銥的複合物作爲催化劑對惰性C-H鍵進行選擇性地氮卡賓插入而生成γ-內酰胺結構。隨後，他們設計和合成了手性金屬銥催化劑，實現了立體選擇性地合成γ-內酰胺結構。雖然手性金屬銥催化劑可以立體選擇性地合成內酰胺結構，但只能對γ位的C-H鍵進行氮卡賓插入，從而生成熱力學更穩定的γ-內酰胺。手性金屬銥催化劑的這種性質，限制了它在立體選擇性合成β/δ-內酰胺的應用。

在本文中，France Arnold課題組通過定向進化的手段，成功改造了三種不同的P411突變體。這三種突變體能夠高效地（高達1,020,000 total turnover number）進行C-H鍵不對稱氮卡賓插入（25:1的區域選擇性，96%的ee值），分別形成手性β-、γ-、δ-內酰胺。他們從實驗室已有的血紅素蛋白庫出發，經過活性測試，篩選出具有催化碳氫鍵酰胺化的蛋白P411突變體E10-V78F S438A (E10FA)。但E10FA活性很差，也不具備反應位點的選擇性，於是對血紅素周圍的氨基酸進行了飽和突變，通過六輪的飽和突變以及活性篩選，最終得到了特異性活化β位sp3 C-H生成β-內酰胺的內酰胺酶（lactam synthase）LSsp3。該酶不僅具有廣譜的底物適應性，還可以高效實現克級製備手性β-內酰胺，這進一步證實了該方法的實用價值，爲合成和開發β-內酰胺型抗生素提供了新的思路。在得到LSsp3後，採用相同的策略，通過對E10FA進行兩輪飽和突變，他們篩選到另一種內酰胺合成酶LSsp2，該突變體能夠選擇性地進行δ-位的sp2 C-H活化，從而生成δ-內酰胺。當底物中同時存在β和γ sp3C-H時，作者發現LSsp3並不具有良好反應位點的選擇性，該酶會以2.2:1的比例同時產生β-和γ-內酰胺。爲了提高sp3 C-H活化的特異性，作者在LSsp3的基礎上又進行了定向進化。當在LSsp3引入額外的三個突變（R327P, P329L,和 A330V）後，該突變體LSβ能夠選擇性活化β位C-H生成β-內酰胺；當引入P329V A330M突變後，該突變體LSγ能夠選擇性活化γ-位C-H生成γ--內酰胺。令人驚奇的是，當底物上同時存在β-、γ-、δ- sp3C-H時，LSβ，LSγ，和LSsp3可以分別特異性地產生β-、γ-、δ-內酰胺。與傳統的貴金屬介導的C-H酰胺化相比，經過改造之後的P411酶不僅具有較高的立體選擇性和超高的反應效率，更重要的是，它能夠生成熱力學不穩定的β-內酰胺以及δ-內酰胺，這是以前的方法無法做到的。

France Arnold課題組近年來通過蛋白定向進化技術，致力於改造血紅素蛋白，使它具有催化多種非天然反應的能力。目前他們已經成功開發出能夠通過卡賓介導的碳氫鍵活化來形成碳-硅鍵，或者高能的碳-碳鍵等全新功能的血紅素蛋白。這些例子以及這篇最新的Science工作充分證明了定向進化的強大之處，它可以迅速賦予合成化學家夢寐以求的新的功能，還可以通過控制關鍵氨基酸位點來精確控制反應位點，這些新的功能都是很難通過自然進化而快速獲取的。可以預見在不久的將來，更多、更具挑戰性的合成問題有望通過對酶的定向進化來解決。這些被發現的、全新的酶促反應機制將進一步加深合成化學家們對有機化學反應的理解，也將進一步豐富合成化學們的合成策略，爲高效製備複雜分子提供新的思路。

https://authors.library.caltech.edu/93736/

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