蛋白質研究再迎新發現，湖北大學團隊發現首個常溫下偏愛性切割RNA的蛋白，有望開發可編程核酸酶工具

“本研究填補了對耐冷細菌來源的原核 Argonaute（pAgo）蛋白質的研究空白，拓寬了對 pAgos 生化性質和催化機理的認知，不僅爲尋找能在中溫條件下具有高效酶切活性的 pAgos 提供了新思路，也爲靶向 RNA 的可編程核酸酶提供了新的選擇。”湖北大學生命科學學院王飛博士表示。

審稿人也給予高度評價：“該工作是 Ago 蛋白質研究中一項重要的新發現，對這個特殊 Ago 蛋白質生物學功能的研究將激發許多有趣的問題，並可能將其發展爲新的生物技術應用工具。”

近日，王飛所在的湖北大學生命科學學院、省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室馬立新教授團隊，報道了一種來自耐冷細菌沼澤粘液桿菌（Mucilaginibacter paludis）的 pAgo 蛋白質——MbpAgo，這也是當下首個在常溫下偏愛切割 RNA 的 pAgo。

該團隊表示，這項工作既拓展了人們對 Ago 蛋白質的認識，也爲開發靶向 RNA 的可編程核酸酶工具提供了新選擇。作爲 RNA 操作的工具酶，MbpAgo 可被作爲開發體內或體外靶向 RNA 的一種新手段。

（來源：Biosensors & Bioelectronics）

據王飛介紹，課題組此前基於 PfAgo 開發了一系列檢測 DNA 和 RNA 的檢測方法。他們發現的 MbpAgo，可作爲靶向 RNA 的可編程核酸酶，並具有開發基於 MbpAgo 特異性檢測 RNA 技術的潛能。

目前，已有報道稱利用 PfAgo 和 TtAgo，可以靶向切割野生型核酸分子，從而富集突變體，實現對突變體的高靈敏度檢測。而該團隊也可利用 MbpAgo 高效切割 RNA 的活性，進行 RNA 突變體的富集，還可對 RNA 末端進行加工，製備末端均一的 RNA 產物。

據介紹，能夠靶向 RNA 的 Cas13，目前已被應用於體內的 RNA 病毒清除。因此，MbpAgo 也可以嘗試進行體內 RNA 病毒的清除工作。此外，還可將 MbpAgo 和參與級聯催化的各種酶進行融合，利用 RNA 支架效應，提高催化反應效率。

挖掘新型 pAgos 蛋白質，助力開發可編程核酸酶工具

此次研究要從 CRISPR-Cas 系統說起，該系統中的 Cas 效應蛋白質，可作爲可編程核酸酶工具，並能對多種細胞和生物的基因組進行有效編輯。目前，CRISPR-Cas 系統已在基因工程和生物醫學等多領域顯示出巨大的應用潛力。

Cas 蛋白質需要在特定的嚮導 RNA介導下，靶向切割互補的靶 DNA 或靶 RNA。Cas 蛋白質使用的嚮導長度一般爲100nt（Cas9）或 43nt（Cas12）左右，且其在切割 DNA 時需要識別特定的 PAM 基序（protospacer adjacent motif）。

作爲另一類可編程核酸酶工具，pAgos 蛋白質利用長度爲 15-25nt 的 DNA 或 RNA 作爲嚮導，靶向切割 DNA 或 RNA。相比 Cas 蛋白質，pAgos 在原核生物中分佈更加廣泛且功能更具多樣性。

截止目前，研究人員只對少數 pAgos 進行了結構或生化性質研究。pAgos 能否發展成爲下一代基因編輯工具尚不清楚。因此，挖掘新型 pAgos 蛋白質，特別是在中溫下具有高催化活性的 pAgos，對開發新的可編程核酸酶工具具有重要意義。

迄今爲止發現的首個偏愛切割 RNA 的 pAgo

該課題組一直從事基因編輯工具的開發與應用研究，尤其是 pAgos 的生化性質與催化機理研究。目前已報道的具有催化活性的 pAgos，都來自嗜熱微生物和中溫微生物。此前還未見耐冷或嗜冷微生物來源 pAgos 的生化性質和催化機理的研究。

在該工作中，王飛和同事對來源於耐冷細菌沼澤粘液桿菌（Mucilaginibacter paludis）的 MbpAgo 進行了系統的生化性質研究。他們發現 MbpAgo 偏愛切割RNA，該性質與已研究的 pAgos 大相徑庭，但與 eAgos 類似。目前報道的大部分 pAgos 偏愛 DNA 靶，真核 Ago 蛋白質（eAgos）偏愛 RNA 靶。

此外，該團隊還發現儘管耐冷細菌沼澤粘液桿菌的生長溫度是 2-33°C，最適生長溫度是 20°C，但 MbpAgo 能在 37°C 具有高效的切割活性。

近日，相關論文以《一種來源於耐冷細菌 Mucilaginibacter paludis 的具有 RNA 靶標偏好的可編程 pAgo 核酸酶》（A programmable pAgo nuclease with RNA target preference from the psychrotolerant bacterium Mucilaginibacter paludis）爲題，發表在 Nucleic Acids Research（IF：16.972）上[1]。博士研究生李文強和劉洋爲第一作者，湖北大學生命科學學院馬立新教授和王飛博士爲通訊作者。

審稿人認爲這項工作延續了該課題組在 pAgos 領域的研究，提供的數據質量很高，同時 MbpAgo 也是迄今發現的、首個以 DNA 爲嚮導偏愛切割 RNA 的 pAgo。

這種對 RNA 靶具有強烈偏愛性的 pAgo 是罕見的，因爲到目前爲止發現的 pAgo 都是偏愛 DNA 靶，只有少數 pAgo 同時具有靶向 DNA 和 RNA 的活性。

偏愛切割 RNA？此“偏愛”非彼“偏愛”

據悉，早期研究的具有催化活性的 pAgos 都來自嗜熱生物，並且均是偏愛靶向切割 DNA。儘管這些 pAgos 與 Cas 蛋白質類似，能在覈酸引導下靶向切割 DNA，但都需要在高溫條件下才具有較好的切割活性，因此不適合在中溫生物中進行基因編輯。

王飛說道：“2016 年，河北科技大學生物科學與工程學院韓春雨教授團隊報道稱，NgAgo 在 37°C 能以 DNA 爲嚮導有效切割 dsDNA，並且實現了 NgAgo 在人類細胞的基因組編輯，這項工作在科研界引起了很大的轟動。因此，NgAgo一度被認爲是繼 CRISPR-Cas 系統之後的下一代基因編輯工具。

然而，這項工作因爲許多實驗室無法重複其所描述的結果而選擇撤稿。隨後多項研究表明 NgAgo 具有靶向切割 RNA 的活性，沒有明確的證據表明 NgAgo 具有靶向切割單鏈 DNA 的活性。

儘管 NgAgo 尚未實現在哺乳細胞中的有效基因編輯。但此類研究也給了我們啓示，即在中溫物種挖掘能在生理溫度下有效切割 dsDNA 的 pAgos，將有望實現 pAgos 在哺乳細胞中的基因編輯。”

2016 年起，該團隊開始啓動從中溫物種挖掘能有效切割 dsDNA 的 pAgo 的研究。2019 年兩支國外團隊報道了中溫微生物來源的 CbAgo 能在 37°C 有效切割 dsDNA。

與此同時，該團隊也從合成的 100 餘條中溫生物來源的 pAgos 基因中，通過異源重組表達和生化研究，發現能夠在 37°C 有效切割 dsDNA 和 RNA 的 KmAgo[2]。接着，國內外多個團隊報道了多個能在中溫有效切割 dsDNA 的不同來源的 pAgos。

王飛和同事發現，這些中溫微生物來源的 pAgo 不僅在中溫下具有酶切活性，在中高溫 50°C 也同樣具有活性。因此，他們推測是否可以從耐冷細菌中進行 pAgo 的挖掘，尋找在中溫具有高的切割活性的 pAgo？隨後，課題組從耐冷細菌沼澤粘液桿菌中挖掘到 MbpAgo，並發現它具有偏愛切割 RNA 的獨特性質。

一度長期無進展，多名同學曾想放棄

儘管已有數篇代表性論文，但該團隊在 Ago 的研究上並不順利。2016 年開始，課題組每年都投入大量的科研經費和人力資源（實驗室所有的博士和部分優秀的碩士研究生）來進行 Ago 相關研究。

當時，整個學界發表的 pAgos 論文只有寥寥幾篇，可供參考的資料的也很少。很多實驗都只能自己探索，這一度讓進展非常緩慢，很多同學都想放棄。馬立新教授發現後，及時把大家組織到一起，講解這項工作的意義和重要性，帶領團隊仔細閱讀已發表的所有 pAgos 相關文獻，研究每一個實驗細節。