馬耳他大圍攻發生在1565年，這是當年奧斯曼帝國入侵馬耳他島，受到醫院騎士團的激烈抵抗的戰役。當時傑爾巴島會戰慘敗的消息傳遍了基督教國家的海岸，人心惶惶，地中海的局勢正在悄然聲息地發生變化。在1564年的夏天，奧斯曼帝國和西班牙帝國都在考慮這下一步計劃。當時的土耳其人沒能充分利用傑爾巴島的大捷來擴大戰果，而就在這個如此短暫的時期內使得西班牙軍隊得以重整旗鼓。

西班牙國王菲利普二世對地中海抱着強烈的慾望，他在軍事上竭盡全力地建造槳帆船。在1564年的9月，伊斯坦布爾還在琢磨如何回應羅姆加最近的襲擊時，西班牙海軍司令堂加西亞就從西班牙南部出發，渡過直布羅陀海峽後，佔領了貝萊斯島嶼要塞。菲利普二世和蘇萊曼除了分別針對地中海之主的霸權地位提出索取外，都在盲目衝向一場決定性的較量之中去。

馬耳他島是地中海中部的關鍵戰略位置，在1564年的秋天，堂加西亞在給菲利普二世的信中分析了奧斯曼帝國威脅到了西班牙帝國在地中海所在的基地。堂加西亞認爲其中受到威脅最嚴重的就是馬耳他島。如果西班牙軍隊能夠守住馬耳他島那麼就能增援南歐海岸，就可以把土耳其人逐出地中海的西部。如果馬耳他陷落將會導致基督教聯盟遭到巨大損害，奧斯曼帝國會將以馬耳他島作爲基地，向歐洲更多地方發起攻擊。

奧斯曼帝國的蘇萊曼在1564年10月6日的國務會議上便決定進攻馬耳他島，一個月後奧斯曼帝國軍隊開始進攻馬耳他島。1965年5月18日早上，聖安傑洛堡和聖埃爾姆堡的觀察哨發現東南方出現了奧斯曼軍隊。此時莊稼還在地裏沒有收割，平民也還沒有疏散，防禦工事仍然沒有完工。土耳其人的艦隊在馬薩什洛克港拋錨，兩天內就登陸了兩萬多人。

不過聖埃爾姆的頑強抵抗拯救了馬耳他島，騎士團乘機搶修比爾古老城和聖米歇爾的防禦工事，西班牙軍隊也在加緊集結着他們的部隊。堂加西亞不願讓新組建的艦隊在還準備好的情況下就暴露在危險中，便先投入了六百人的先遣部隊參與支援。西班牙軍隊在同年的6月30日突破奧斯曼軍隊的的封鎖後，送援軍登陸並抵達了比爾古，使得馬耳他守軍士氣大增。

後來西班牙主力軍隊到來後，戰場上的上風偏向到了基督教聯盟這邊，西班牙軍隊不等命令就向奧斯曼軍隊發起最後的猛擊，在馬耳他島的老城中展開了巷戰。損失慘重的的奧斯曼軍隊急忙乘上即將返回東地中海的帆槳戰艦。在9月12日，奧斯曼帝國軍隊終於大敗而逃。馬耳他島的醫院騎士團成員和馬耳他平民，再加上西班牙帝國共同取得了這場圍城戰的勝利。這是歷史上基督教聯盟和奧斯曼帝國爭霸的高潮，也是當年十六世紀歐洲最著名的戰役之一。