（2）製備免疫脾細胞

最後一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死

↓

無菌取脾臟，培養液洗 一次

脾臟研碎，過不鏽鋼篩網

離心，細胞用培養液洗2次

計數

取108脾淋巴細胞懸液備用

（3）製備骨髓瘤細胞

取對數生長骨髓瘤細胞離心

用無血清培養液洗2次

計數，取得×107細胞備用

（4）融合

①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸淨殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略鬆動。

②90s內加入37℃預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。

③加37。C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

④離心，800rpm, 6min。

⑤充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。

⑥將上述細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。

⑦將培養板置37℃、5%CO2培養箱中培養。

（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測

1．HAT選擇雜交瘤細胞　脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理後，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞纔有意義。在HAT選擇培養液中培養時，由於骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養液可以生長繁殖。

在用HAT選擇培養1～2天內，將有大量瘤細胞死亡，3～4天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養液維持7～10天后應換用HT培養液，再維持2周，改用一般培養液。在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞佈滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養期間，一般每2～3天換一半培養液。

2．抗體的檢測 檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法爲原則。

常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用於可溶性抗原、細胞McAb的檢測。（2）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）可用於可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合於細胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘附雙層吸附試驗等。