在此期间，虽然紫外线与鱼肝油同样有防治佝偻病的功效已肯定，但人们还不能解释其原因，也不了解两者之间有何联系。1923年，Goldblatt 和Soames 发现经紫外线照射的大鼠肝脏有抗佝偻病作用。1924年，Steenbock和Black发现经紫外线照射的酵母对佝偻病大鼠有疗效，此后陆续发现紫外线照射其它食物也有类似的效果，特别是牛奶经照射后，抗佝搂病效果显著增加。1932年， Windaus,Askew 等鉴定出麦角固醇(VD2)的化学结构。1936年,Windaus等测定紫外线照射7-脱氢胆固醇生成的“抗佝偻病因子”，查明胆钙化醇(VD3)的结构。差不多与此同时，人们从鱼肝油中也分离出结晶的胆钙化醇(Brockman,1936,1937)这些实验说明7-脱氢胆固醇是VD3的前体，鱼肝油中的“抗佝偻病因子”就是维生素D。

1930～1960年，不同学者对维生素D与钙、磷代谢、骨质生成和骨盐周转 （turnover）的关系进行了大量的研究，对维生素D对有机酸（柠檬酸）代谢、肠粘膜上皮细胞膜的通透性及动物生长的作用也进行了许多观察，但还很难把这些多种多样的研究结果综合起来说明维生素D生物化学作用的机理。

放射性同位素在医学研究中的应用，为人们探讨维生素D的生理作用开创了广阔的道路。Lindquist ，B(1952)用 45Ca 研究维生素D对钙代谢的作用，发现15IU的维生素D2可以使佝偻病大鼠肠钙的吸收在 4h内达到最高峰，血清钙的最高值在6h内出现，在36～48 h 才看到其对骨钙沉积的作用，此后，人们对维生素D作用的“滞后”(the lag in action of vitamin D)又进行了许多实验观察。

虽然由于维生素D的使用剂量及所采用的测定方法不同，直接比较这些测定结果是困难的，但人们注意到机体对维生素D的各种生理反应都存在着“滞后”的现象，这点仍是很重要的。人们还注意到在体内给以一定量的维生素D，其生理作用仍不明显。这提示原型维生素D可能必须在体内经过代谢后，才能形成活性物质而发挥其生理作用，也可能与VD的吸收及运转到靶组织与受体起作用需要一定时间有关。另外，在临床上观察到某些尿毒症患者，常伴有骨骼的病理变化，使用大剂量维生素D也无明显疗效，若是给这种病人先做肾脏移植后再给维生素D，则骨骼的病变可以消失。这说明维生素D的生理活性，对骨骼病变的防治作用及肾功能是否良好有密切的关系。