在此期間，雖然紫外線與魚肝油同樣有防治佝僂病的功效已肯定，但人們還不能解釋其原因，也不瞭解兩者之間有何聯繫。1923年，Goldblatt 和Soames 發現經紫外線照射的大鼠肝臟有抗佝僂病作用。1924年，Steenbock和Black發現經紫外線照射的酵母對佝僂病大鼠有療效，此後陸續發現紫外線照射其它食物也有類似的效果，特別是牛奶經照射後，抗佝摟病效果顯著增加。1932年， Windaus,Askew 等鑑定出麥角固醇(VD2)的化學結構。1936年,Windaus等測定紫外線照射7-脫氫膽固醇生成的“抗佝僂病因子”，查明膽鈣化醇(VD3)的結構。差不多與此同時，人們從魚肝油中也分離出結晶的膽鈣化醇(Brockman,1936,1937)這些實驗說明7-脫氫膽固醇是VD3的前體，魚肝油中的“抗佝僂病因子”就是維生素D。

1930～1960年，不同學者對維生素D與鈣、磷代謝、骨質生成和骨鹽週轉 （turnover）的關係進行了大量的研究，對維生素D對有機酸（檸檬酸）代謝、腸粘膜上皮細胞膜的通透性及動物生長的作用也進行了許多觀察，但還很難把這些多種多樣的研究結果綜合起來說明維生素D生物化學作用的機理。

放射性同位素在醫學研究中的應用，爲人們探討維生素D的生理作用開創了廣闊的道路。Lindquist ，B(1952)用 45Ca 研究維生素D對鈣代謝的作用，發現15IU的維生素D2可以使佝僂病大鼠腸鈣的吸收在 4h內達到最高峯，血清鈣的最高值在6h內出現，在36～48 h 纔看到其對骨鈣沉積的作用，此後，人們對維生素D作用的“滯後”(the lag in action of vitamin D)又進行了許多實驗觀察。

雖然由於維生素D的使用劑量及所採用的測定方法不同，直接比較這些測定結果是困難的，但人們注意到機體對維生素D的各種生理反應都存在着“滯後”的現象，這點仍是很重要的。人們還注意到在體內給以一定量的維生素D，其生理作用仍不明顯。這提示原型維生素D可能必須在體內經過代謝後，才能形成活性物質而發揮其生理作用，也可能與VD的吸收及運轉到靶組織與受體起作用需要一定時間有關。另外，在臨牀上觀察到某些尿毒症患者，常伴有骨骼的病理變化，使用大劑量維生素D也無明顯療效，若是給這種病人先做腎臟移植後再給維生素D，則骨骼的病變可以消失。這說明維生素D的生理活性，對骨骼病變的防治作用及腎功能是否良好有密切的關係。