RNA，一度被認爲僅存在於細胞內，但現在我們已經知道RNA在細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）的保護下遍及全身。如今，對細胞外RNA（extracellular RNA，exRNA）的研究正在悄悄地引發一場生物學革命，越來越多的科學家致力於瞭解細胞爲何又如何釋放RNA，以及exRNA在檢測和治療疾病中的潛力。

近日，南京大學生命科學院院長張辰宇教授受國際頂尖學術期刊 Nature 雜誌邀請，組織了題爲《Extracellular RNA》的系列文章，系統報道了細胞外RNA領域最受關注和最前沿的研究。系列文章以增刊形式（Nature Outlook）發表。

其中張辰宇教授發表了Nanjing School: Extracellular microRNA mediates co-evolution between species （南京學派：細胞外miRNA介導物種之間的共同進化）的Highlight文章。

“監聽”exRNA編碼的細胞間通訊有望揭示癌症等疾病的早期信號。目前也有多項研究正在開發能夠追蹤體液中這些細胞外片段的方法。在疾病治療方面，攜帶RNA的囊泡有望在治療心血管、神經系統和免疫系統疾病時替代幹細胞療法，成爲更安全也更簡便的治療選擇。

值得一提的是，研究人員正在探索如何讓攜帶RNA的囊泡穿過血腦屏障，來遞送治療藥物。相比關注度更高的人造納米顆粒，這些天然囊泡具有更多優勢。

除了潛在的臨牀應用，exRNA可能還對飲食有着神祕影響。南京大學張辰宇教授團隊的一系列研究發現，我們所喫食物的的RNA對人體基因表達存在某種調控關係。此後，大量研究開始探索我們的食物與身體之間的“交流”。也有研究在觀察母乳中的RNA對嬰兒健康的影響。

對於植物科學來說，由於我們對exRNA的生物學意義更清晰的認識 ，研究人員得以通過遺傳修飾來增強作物的抗病害能力。

南京學派

在過去十多年裏，由南京大學張辰宇教授領銜的南京大學生科院研究團隊，專注於細胞外miRNA研究。

2008年，張辰宇團隊在 Cell Research 雜誌發表關於miRNA可在人類和動物的血清和血漿中穩定存在的原創發現【1】。該研究開創了細胞外RNA研究的新領域，也成爲所有血清miRNA生物標誌物研究的基礎。截至目前，pubmed顯示該論文被引用1529次，谷歌學術顯示被引用4531次，成爲中國學者被引用數量最多的論文（之一）。

BioWorld特別梳理了以張辰宇教授爲代表的南京學派（Nanjing School）關於細胞外miRNA的系列研究進展。

核酸研究的三個歷史性階段

核酸研究可分爲三個歷史性階段，其中前兩個階段屬於細胞內時代，第三個階段則屬於細胞外時代。

第一階段：在這一階段，人們已瞭解到DNA和RNA攜帶遺傳信息，但它們被認爲缺乏任何進一步的生物學功能。

第二階段：在這一階段，隨着核酶、siRNA和miRNA的發現，表明RNA可以具有類似蛋白質的功能，但人們仍然認爲RNA侷限於細胞內環境。

第三階段：張辰宇團隊於2008年發現血清和血漿中穩定存在miRNA，隨後還發現植物性食物和中藥湯劑中的植物miRNA可跨界調控人體基因表達，這些發現表明，miRNA在細胞外同樣具有生物學功能。

血清miRNA作爲潛在生物標誌物

2008年，張辰宇團隊在在 Cell Research 雜誌發表關於miRNA可在人類和動物的血清和血漿中穩定存在的原創發現【1】，該研究使用深度測序對人血清中的miRNA譜進行了表徵，並確定了獨特的血清miRNA模式，從而將癌症和糖尿病患者與健康受試者區分開。這些發現表明，特定的血清miRNA譜可作爲疾病診斷標誌物。

同年，弗雷德·哈欽森癌症研究中心Muneesh Tewari等人在 PNAS 發表論文，將血漿miRNAs確定爲前列腺癌的有前途的生物標誌物【2】。

這些研究挑戰了RNA在含有降解RNA的核酸酶的細胞外環境中不穩定的經典觀點。此後，越來越多的證據表明，miRNA在包括唾液，尿液和母乳在內的細胞外生物體液中以穩定、無細胞形式循環，由於細胞外miRNA與癌症和糖尿病等疾病緊密相關，因此細胞外miRNA有潛力成爲疾病診斷的生物標誌物。

分泌的miRNA

儘管細胞外環境中存在降解RNA的核酸酶，但細胞外miRNA在體液中循環的發現表明存在保護miRNA免受降解的機制。

南京學派的一些列工作研究了細胞外囊泡（EV）是否可以作爲保護miRNA在細胞外環境中不被降解的屏障。

張辰宇團隊研究發現，循環血漿中的大多數miRNA都存在於血漿的外泌體（Exosome）和微泡（Microvesicles）中，而不是無細胞外囊泡的血漿中【3】。

進一步地，張辰宇團隊提出了兩種模型【4】來解釋細胞外miRNA的穩定性：（i）EV膜結構對miRNA的保護；（ii）通過形成蛋白質-miRNA複合物來穩定miRNA。

此外，張辰宇團隊還提出了細胞外miRNA產生的三種主要途徑：（i）EV以能量依賴的選擇性過程主動分泌；（ii）與RNA結合蛋白結合，從供體細胞釋放；（iii）由於組織損傷、細胞凋亡或壞死而從破碎或損壞的細胞中被動分泌。

分泌到細胞外的miRNA可以靶向多個基因，從而影響特定的靶細胞。張辰宇團隊在Cell Research 的一項研究表明，腫瘤細胞分泌的miRNA可導致腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤細胞增殖【5】。

這些研究表明，異常分泌的miRNA可能導致細胞功能障礙和疾病，預示着我們對細胞間信號轉移的理解進入新時代。

植物miRNA

張辰宇團隊的一個研究重點是miRNA是否可以在遠緣的複雜生物之間轉移，如果可以，那麼miRNA是否可以促進物種之間的串擾（crosstalk）?

人類幾乎每天都在食用諸如穀物、蔬菜和水果等植物性食品，研究團隊假設外源性植物miRNA可以承受胃酸和胃腸道中的消化酶並進入組織中。

2011年，張辰宇團隊在 Cell Research 雜誌發表論文【6】，該研究通過人血清中全部miRNA表達譜，發現外源植物miRNA在中國健康男性和女性的血清中一直存在。其中MIR156a和MIR168a顯示出相當程度的表達。

進一步的體外和體內分析首次證實，食物來源的外源植物MIR168a可以通過小鼠胃腸途徑並進入循環和各種器官，特別是在肝臟中跨物種調節小鼠LDLRAP1蛋白表達。

這項研究首次表明，食物中的外源植物miRNA可以調控哺乳動物靶基因的表達。

在許多國家，都有“You are what you eat”的俗語，人如其食，以食物賦予健康爲基礎，張辰宇團隊正致力於研究食用植物可以給人類帶來益處的生物學機制。

miRNA的跨界調控

從進化的角度來看，miRNA的跨物種轉移在促進遠緣物種串擾、交流和信號傳播方面具有獨特的地位。

2017年，南京大學生命科學院陳熹團隊在 PLOS Genetics 雜誌發表研究論文【7】。

該研究顛覆性發現，蜂糧裏的植物miRNA通過抑制蜜蜂幼蜂的卵巢和整體的生長發育，使之成爲工蜂。而蜂王漿中不含有植物miRNA，因此喫到蜂王漿的幼蜂則發育爲蜂王。這與之前認爲蜂王漿中含有特殊有益物質讓幼蜂發育成蜂王的認識恰好相反。

更重要的是，這項研究提示了蜜蜂和開花植物之間以共同進化的關係向彼此施加選擇性壓力，從而影響相互連接的生態系統中的彼此命運。

考慮到物種經歷了數百萬年的共同進化以形成我們今天生活的生態系統，跨界miRNA轉移可能在自然界中很常見。實際上，越來越多的證據表明，miRNA可以跨越物種（Species）甚至界（Kingdom）以傳播基因沉默信號，從而充當連接動物、植物和微生物界的紐帶。

中草藥中的miRNA調控

中國傳統醫學，特別是中草藥，在中國用於治療和預防疾病已有數千年的歷史了。但是，由於缺少在隨機對照臨牀試驗中進行嚴格的測試，因此中醫中採用的許多理論和實踐在科學上並未得到證實。

一些研究將中草藥的作用歸因於次級代謝產物和小分子物質。往往沒有考慮大分子物質，例如RNA。

RNA被認爲不能在胃腸道中穩定存在，並且中草藥往往需要在水中煮沸數小時以產生水煎劑，因此通常認爲RNA在製備過程中會降解。 因此，對中草藥湯劑的科學研究常常將RNA從生物活性成分中排除了。

2014年，張辰宇團隊在 Cell Research 發表研究論文【8】。中醫中被廣泛用於治療流感的金銀花，其編碼的MIR2911，由於高GC含量和特殊序列，能夠在煮沸後的金銀花湯劑中仍能完整保留，體外細胞實驗表明，MIR2911可以靶向並抑制甲型流感病毒的多個病毒基因。

小鼠實驗則表明，飼餵金銀花湯劑的小鼠血液和肺中MIR2911顯著升高，且MIR2911抑制了各種甲流病毒（包括H1N1，H5N1和H7N9）在小鼠體內的複製，減輕了病毒感染引起的體重減輕，並降低了小鼠死亡率。

該研究提供了第一個證據，證明植物miRNA可能是中藥中的活性成分，並確定了首個有助於抑制病毒感染的植物miRNA。

新冠病毒（SARS-CoV-2）大流行再次強調了病毒對公共健康構成的威脅。而且病毒可以迅速突變，這意味着研發有效的疫苗可能是一個挑戰。因此，開發廣譜抗病毒藥物可以幫助爲將來的疫情爆發做好準備。富含MIR2911和MIR2911的金銀花湯劑可能是抑制病毒感染的潛在治療策略。

從基礎研究到實際應用

基礎研究的最終目標是將新發現轉化爲實際應用。從這個角度來看，miRNA在細胞外環境中的穩定存在激發了三個重要的研究方向：

i）細胞外miRNA具有作爲疾病診斷生物標誌物的潛力；

ii）細胞外囊泡封裝的miRNA具有基於RNAi的基因治療的潛力；

iii）基因改造食用植物以生物合成miRNA作爲藥物，具有直接通過食用進行基因治療的潛力。

RNAi療法

RNAi技術自誕生以來就被寄予厚望，但缺乏安全有效的遞送系統阻礙了其臨牀應用。

爲解決RNAi療法的遞送難題，張辰宇團隊探索了細胞外囊泡（EV）作爲小RNA遞送載體的潛力。研究團隊通過招募人體自己的細胞外囊泡作爲RNA轉運系統，這樣內源性細胞分泌的天然囊泡，既可以保護小RNA跨細胞和生物屏障運輸，還具有很好的生物相容性。

2014年5月，張辰宇團隊等在 BioMaterials 雜誌發表論文【9】，通過微泡遞送靶向TGFβ1的siRNA,，成功抑制了小鼠腫瘤生長。

儘管在注射、透皮和鼻腔等給藥途徑取得了顯著進步，但對患者來說，口服給藥更方便，因此成爲首選。但是RNAi療法的口服給藥被胃腸道中的生理屏障所阻礙。

而miRNA的跨界轉移的研究進展可能有助於克服RNAi療法口服給藥面臨的主要挑戰。植物的某些miRNA對胃腸消化過程的抵抗，讓植物成爲治療性miRNA的理想載體。

2019年6月，張辰宇團隊等在BioMaterials 雜誌發表論文【10】，該研究設計並開發了一種基因工程生菜，以生物合成人工miRNA，以生菜的內源性miRNA生物發生機制特異性靶向乙肝病毒表面抗原基因（HBsAg）。口服生菜湯後，人造miRNA被吸收並傳遞到肝臟中，以抑制轉基因小鼠中HBsAg的表達。

治療15個月後，HBsAg的表達降低，轉基因小鼠模型的肝損傷明顯減輕，且未觀察到毒理作用。

由於工程植物生產干擾序列的有效性、無毒性且經濟可行的優勢，這種方法也可以拓展到丙型肝炎或其他傳染疾病的治療。可以預測，植物來源的干擾RNA將在RNAi基因治療中帶來一場新的“綠色革命”。

細胞外RNA正在悄悄引發一場生物學革命，而細胞外miRNA在疾病生物標誌物、基因治療、藥物遞送等領域的突破性進展，也讓我們見證了小RNA的大能量。

張辰宇教授

張辰宇，南京大學教授、博導、南京大學生命科學院院長、南京大學生命科學高等研究院院長，國家傑出青年基金獲得者，長江學者。

張辰宇教授領導的3M實驗室（MicroRNA、Mitochondrion & Metabolism）近十年來在國際上開拓了許多前沿領域，一直處於國內最頂尖小RNA研究實驗室行列。張辰宇教授在 Cell、Nature、Science及其子刊、JCI、PNAS、Cell Research等雜誌上發表論文超過200篇，總引42000餘次，H指數85。

參看文獻：

1、Chen Xi,Ba Yi,Ma Lijia et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.[J] .Cell Res., 2008, 18: 997-1006.

2、Mitchell Patrick S,Parkin Rachael K,Kroh Evan M et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.[J] .PNAS., 2008, 105: 10513-8.

3、Zhang Yujing,Liu Danqing,Chen Xi et al. Secreted monocytic miR-150 enhances targeted endothelial cell migration.[J] .Mol. Cell, 2010, 39: 133-44.

4、Chen Xi,Liang Hongwei,Zhang Junfeng et al. Secreted microRNAs: a new form of intercellular communication.[J] .Trends Cell Biol., 2012, 22: 125-32.

5、Yin Yuan,Cai Xing,Chen Xi et al. Tumor-secreted miR-214 induces regulatory T cells: a major link between immune evasion and tumor growth.[J] .Cell Res., 2014, 24: 1164-80.

6、Zhang Lin,Hou Dongxia,Chen Xi et al. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA.[J] .Cell Res., 2012, 22: 107-26.

7、Zhu Kegan,Liu Minghui,Fu Zheng et al. Plant microRNAs in larval food regulate honeybee caste development.[J] .PLoS Genet., 2017, 13: e1006946.

8、Zhou Zhen,Li Xihan,Liu Jinxiong et al. Honeysuckle-encoded atypical microRNA2911 directly targets influenza A viruses.[J] .Cell Res., 2015, 25: 39-49.

9、Zhang Yaqin,Li Limin,Yu Jianxiong et al. Microvesicle-mediated delivery of transforming growth factor β1 siRNA for the suppression of tumor growth in mice.[J] .Biomaterials, 2014, 35: 4390-400.

10、Zhang Shuo,Sang Xiaolin,Hou Dongxia et al. Plant-derived RNAi therapeutics: A strategic inhibitor of HBsAg.[J] .Biomaterials, 2019, 210: 83-93.

相關文章