今年，COVID-19在全球傳播，David Montefiori想知道導致這種大流行的致命病毒在人際傳播過程中可能會發生怎樣的變化。Montefiori是一名病毒學家，他的大部分職業生涯都在研究HIV的偶然突變是如何幫助它逃避免疫系統的。他認爲，同樣的事情也可能發生在SARS-CoV-2身上。

今年3月，在杜克大學領導艾滋病疫苗研究實驗室的Montefiori聯繫了他的長期合作伙伴、HIV演化方面的專家Bette Korber。Korber是新墨西哥州洛斯阿拉莫斯國家實驗室（LANL）的計算生物學家，她已經開始搜索數千個冠狀病毒基因序列，尋找可能在全球傳播過程中改變病毒特性的突變。

與艾滋病毒相比，SARS-CoV-2在傳播過程中的變化要慢得多。但有一個突變讓Korber很感興趣。它存在於編碼刺突蛋白的基因中，該蛋白能夠幫助病毒顆粒穿透細胞。Korber發現這種突變在COVID-19患者的樣本中反覆出現。在刺突蛋白的第614個氨基酸位置，由於複製錯誤而改變了病毒RNA序列29,993個核苷酸其中之一，使得天門冬氨酸（生物化學中縮寫爲D）有規律地被甘氨酸（G）取代。病毒學家稱之爲D614G突變。

今年4月，Korber、Montefiori和其他人在bioRxiv上發佈的預印本中發出了警告，稱“D614G突變發生的頻率正以驚人的速度增長”[1]。它迅速成爲歐洲主要的SARS-CoV-2譜系，隨後發展到美國、加拿大和澳大利亞。論文宣稱，D614G代表了一種“傳染性更強的SARS-CoV-2”，它是自然選擇的產物。

這些觀點使許多科學家感到沮喪。他們說，目前還不清楚D614G病毒譜系是否傳染性更強，也不清楚其出現是否表明有任何異常。但這一警報迅速傳遍了媒體。儘管許多新聞報道包括了研究人員的說明，但一些新聞標題宣稱病毒正在向更危險的方向發生變異。回想起來，Montefiori說，他和他的同事後悔將這種變異的增長描述爲“驚人的”（alarming）。在7月2日發表在《細胞》雜誌上的同行評議版本中，這個詞被刪除了[2]。

這篇文章激起了人們對D614G的狂熱興趣。即使是那些不相信這種突變已經改變了病毒特性的人也認爲它是有趣的——因爲它的迅速出現和普遍性。幾個月來，在幾乎所有的SARS-CoV-2測序樣本中都發現了這一譜系（見“全球傳播”）。

他說：“這一變異株現在成了大流行。因此，它的特性很重要。”耶魯大學公共衛生學院的病毒流行病學家Nathan Grubaugh，和他的兩位同事在一篇針對Korber和Montefiori相關發現的《細胞》短評中寫道[3]。

到目前爲止，這項工作的結果並不像Montefiori和Korber的預印本所暗示的那麼清楚。一些實驗表明，攜帶這種變異的病毒更容易感染細胞。其他工作則揭示了可能的好消息：這種變異或許意味着疫苗可以更容易靶向SARS-CoV-2。

但許多科學家說，目前還沒有確鑿的證據證明D614G對病毒的傳播有顯著影響，也沒有確鑿的證據證明它的上升是自然選擇的結果。北卡羅來納大學教堂山分校的冠狀病毒學家Timothy Sheahan說：“這種突變可能意味着什麼，也可能沒有什麼。目前尚無定論。”

Sheahan、Grubaugh和其他人表示，研究人員對於冠狀病毒突變仍有更多的疑問而不是答案，而且還沒有人發現任何應該引起公共衛生關注的SARS-CoV-2變化。但是研究突變的細節可能對控制大流行很重要，還可能有助於預防最令人擔憂的突變，即那些可能幫助病毒逃避免疫系統、疫苗或抗體療法的突變。

變化的出現

在中國發現SARS-CoV-2後不久，研究人員開始分析病毒樣本，並將其遺傳信息發佈到網上。變異——通常是那些不同個體所攜帶病毒之間的單核苷酸變異——使研究人員能夠將密切相關的病毒聯繫起來並追蹤病毒的傳播，以此推測SARS-CoV-2開始感染人類的時間。

某些病毒基因組由RNA編碼，如SARS-CoV-2、HIV和流感病毒，在宿主體內複製時往往會迅速發生突變，因爲複製RNA的酶很容易出錯。例如，在嚴重急性呼吸系統綜合徵（SARS）病毒開始在人類中傳播後，它產生了一種缺失突變，這可能減緩了它的傳播速度[4]。

但測序數據表明，冠狀病毒的變化速度比大多數其他RNA病毒都要慢，這可能是因爲一種“校對”酶可以糾正潛在致命的複製錯誤。瑞士巴塞爾大學的分子流行病學家Emma Hodcroft說，一種典型的SARS-CoV-2病毒在其基因組中每個月只會積累兩個單核苷酸變異——這一變化率大約是流感病毒的二分之一以及艾滋病的四分之一。

目前已經對超過9萬個分離株進行了測序並公開（見www.gisaid.org），而其他基因組數據也強調了這種穩定性。倫敦大學學院的計算遺傳學家Lucy Van Dorp說，從世界上任何地方收集的兩株SARS-CoV-2病毒，在其長達29,903個核苷酸的RNA序列中平均只有10個不同。她正在追蹤這些差異，尋找那些賦予其演化優勢的跡象。

儘管SARS-CoV-2病毒的突變率很低，但研究人員已經對超過12000個SARS-CoV-2基因突變進行了分類。然而科學家發現突變的速度比理解這些突變的速度要快。許多突變對病毒傳播或致病的能力沒有影響，因爲它們不會改變蛋白質的形狀，而那些改變蛋白質的突變更有可能損害而不是改進病毒。Hodcroft是致力於實時分析SARS-CoV-2基因組的Nextstrain項目成員，他說：“破壞比修復要容易得多。”

許多研究人員推測，如果某種突變確實幫助病毒傳播得更快，那這種突變的產生很可能早於病毒第一次感染人類或獲得有效人傳人的能力。在這個地球上幾乎每個人都易受感染的時期，可能並沒有什麼演化壓力促使病毒更好地傳播，所以即使是潛在有益的突變也可能不會迅速發展。哈佛大學陳曾熙公共衛生學院的流行病學家William Hanage說：“就病毒而言，每一個被它感染的人都是一塊好肉。並沒有讓病毒更強大的選擇壓力。”

快速傳播

當Korber看到D614G的快速擴散時，她想她可能已經找到了一個有意義的自然選擇的例子。這種突變能夠引起她的注意是因爲它在刺突蛋白中的位置，刺突蛋白是“中和”抗體的主要靶點，這種抗體與病毒結合並使病毒無傳染性。而且這種變異的病毒在世界上多個地區的出現頻率也在上升。

1月下旬，在中國和德國收集的病毒樣本中首次發現D614G；大多數科學家推測這種突變發生在中國。現在，它幾乎總是伴隨着SARS-CoV-2基因組其他部分的三種突變——這可能是大多數D614G病毒有着共同祖先的證據。

D614G在歐洲的迅速發展引起了Korber的注意。在今年3月歐洲大陸大部分地區被封鎖之前，存在着未突變的D病毒和突變的G病毒，遺傳學家當時取樣的D病毒在大多數西歐國家流行。Korber、 Montefiori和他們的團隊報告說，在三月份，G病毒在整個非洲大陸出現頻率上升，到四月份則佔了主導地位[1, 2]。

但是有利於G病毒的自然選擇並不是對這種模式唯一的解釋，甚至也不是最有可能的解釋。G變種在歐洲的優勢可能只是由於偶然，例如，這種變異碰巧在到達歐洲的病毒中更常見一些。

少數個體似乎對大多數病毒的傳播負有責任，早期偶然傾向於G病毒可以解釋該譜系現在明顯的優勢。這種創始者效應（founder effects）在病毒中很常見，尤其是當病毒不受控制地傳播時，就像3月中下旬前SARS-CoV-2在歐洲大部分地區的傳播情況。

Korber和她的同事試圖排除創始者效應，他們在4月的預印本[1]中表示，D614G在加拿大、澳大利亞和美國部分地區迅速佔據主導地位（冰島是個例外，在那裏G病毒在其暴發早期被D病毒取代）。該團隊分析了來自英國謝菲爾德的住院數據，並沒有發現攜帶這種突變的病毒使人們病情加重的證據。但是，感染G病毒的人的鼻子和口腔中的病毒RNA水平似乎比感染D病毒的人略高。

許多科學家不相信D614G的上升是顯著的，或者與大流行有那麼大的關係。Sheahan說：“我認爲該預印本非常不成熟。”

Montefiori說，他和Korber對D614G的看法基於他們對艾滋病毒的研究。他們發現，即使是看起來不重要的突變也會對免疫系統識別這種病毒產生深遠的影響。“我們對此感到震驚，我們需要看它是否會對疫苗產生影響。”他說。

大量實驗室研究

爲了進一步檢驗D614G是否提高了病毒的傳播能力，Montefiori在實驗室條件下評估了它的效果。由於需要生物安全控制，他不能在實驗室裏研究天然的SARS-CoV-2病毒。因此，他研究了一種利用SARS-CoV-2刺突蛋白感染細胞的轉基因艾滋病病毒。這種“假病毒”顆粒是病毒學實驗室的主要工具：它們使對埃博拉病毒等致命病原體進行安全研究成爲可能，也使檢測突變的影響變得容易。

今年6月第一個報告針對D614G進行假病毒實驗的團隊，是由斯克裏普斯研究所[5]的病毒學家Hyeryun Choe和Michael Farzan領導的。其他幾個團隊也在bioRxiv上發佈了類似的研究（Montefiori的實驗和另一個合作者的實驗都發表在《細胞》雜誌上[2]）。

這些研究小組使用了不同的假病毒系統，並在不同種類的細胞上進行了測試，但實驗得出了相同的結論：攜帶G突變的病毒感染細胞的能力要比攜帶D突變的病毒強得多，在某些情況下，其效率是D突變病毒的10倍。

在實驗室測試中，“我們所有人都一致認爲，從D到G使病毒顆粒更具傳染性。” 馬薩諸塞大學醫學院的病毒學家Jeremy Luban說。但是這些研究附帶了許多警告，而且它們與人類感染的相關性尚不清楚。Grubaugh說：“讓人惱火的是，大家在非常嚴格的控制條件下得出結果，並說這對大流行意味着什麼。事實上我們還遠遠不知道。”

在大多數情況下，假病毒只攜帶冠狀病毒刺突蛋白，因此實驗只測量了這些顆粒進入細胞的能力，而沒有測量它們在細胞內的影響，更不用說對生物體的影響了。它們也缺乏幾乎所有D614G病毒所攜帶的其他三種突變。“歸根結底，它們並不是這個病毒。”Luban說。

一些實驗室現在正在研究只在單個氨基酸上有所不同的傳染性SARS-CoV-2病毒。在實驗室培養的人類肺和氣管細胞中，以及在雪貂和倉鼠等實驗室動物中進行測試。Sheahan說，對於有經驗和生物安全能力來操縱病毒的實驗室來說，“這就像是一些最基礎的工作。”第一項研究是由德克薩斯大學醫學分部的研究人員領導的，發佈在9月2日的預印本上[6]。研究發現，在人類肺細胞系和氣道組織中，突變病毒比D病毒更具傳染性，而且在感染倉鼠的上呼吸道中，突變病毒的含量更高[6]。

即使是這些實驗也不能提供絕對的答案。一些研究表明，中東呼吸綜合徵（MERS）病毒刺突蛋白的某些突變能夠造成小鼠更嚴重的感染，而該蛋白中的其他突變對人和可能是人MERS感染病毒宿主的駱駝只有很小的作用，愛荷華大學的冠狀病毒學家Stanley Perlman表示。

D614G對人類SARS-CoV-2傳播有影響的最明顯的證據來自一個雄心勃勃的英國研究項目——COVID-19英國基因組學聯盟（COVID-19 Genomics UK Consortium），該項目分析了大約25000個病毒樣本的基因組。從這些數據中，研究人員確定了1300多個病毒進入英國並傳播的例子，包括D型和G型病毒。

由英國愛丁堡大學演化生物學家Andrew Rambaut、倫敦帝國理工學院流行病學家Erik Volz和卡迪夫大學生物學家Thomas Connor領導的研究小組，研究了由D病毒傳播的62個COVID-19集羣和由G病毒傳播的245個集羣在英國的傳播情況。

研究人員在感染這兩種病毒的人中沒有發現臨牀差異。然而，G病毒傾向於比不攜帶變異的譜系傳播速度稍快，並形成更大的感染羣。Volz說，他們對傳播率差異的估計徘徊在20%左右，但真正的數值可能更高或更低。“從絕對意義上講，這並沒有太大的影響。”Rambaut說。

Rambaut說，D614G可能是一種適應，它幫助病毒感染細胞或與不攜帶這種突變的病毒競爭，而對SARS-CoV-2在人與人之間或在人羣中傳播的方式幾乎沒有改變。“這可能是對人類或某些人類細胞真正的適應，”Grubaugh表示同意，“但這並不意味着任何改變。適應並不一定要讓它更具傳染性。”

Grubaugh認爲D614G已經獲得了科學家們太多的關注，部分原因是已經有許多關於它的高知名度論文。“科學家們對這些突變有着瘋狂的迷戀。”他說。但他也認爲D614G是瞭解這種基因多樣性不高的病毒的方法之一。他說：“身爲病毒學家的我看着這些東西，會覺得研究起來很有趣。它創造了一個完整的兔子洞，你可以深入探究不同的東西。”

也有其他研究者和Grubaugh持相同觀點。Luban說，對D614G的深入研究應有助於解釋SARS-CoV-2如何與細胞融合，這個過程或許能被藥物阻斷或被疫苗靶向。

7月16日發佈在bioRxiv上的一篇更新版的假病毒實驗中[8]，Luban的團隊使用冷凍電鏡分析了帶有D614G突變的刺突蛋白結構。這種刺突蛋白由三個相同的肽段組成，它們按“開放”或“閉合”的方向排列。先前的研究表明，其中至少兩個多肽需要呈開放狀態，從而使病毒顆粒與細胞膜融合[9]。

Luban的研究團隊發現，攜帶G刺突蛋白突變的病毒變種更有可能處於這種狀態（見“使刺突蛋白變鬆散的突變”）。Montefiori和Korber在LANL的同事Sandrasegaram Gnanakaran領導下進行的計算建模工作得出了同樣的結論[10]。Luban說：“看起來這個分子機器已經準備好以某種方式運行，而D病毒則不可以。”

尚且無法逃脫抗體

大多數現有證據表明，D614G不能阻止免疫系統的中和抗體識別SARS-CoV-2，這正是Montefiori擔心的。這可能是因爲突變不在刺突蛋白的受體結合區域（RBD）——許多中和抗體的靶點：RBD與細胞受體蛋白ACE2結合是病毒進入細胞的關鍵一步。

但有證據顯示，其他突變可能有助於病毒逃避某些抗體。洛克菲勒大學的病毒學家Theodora Hatziioannou和Paul Bieniasz領導的一個研究團隊，對一種家畜病原體水皰性口炎病毒進行了基因改造，使其利用SARS-CoV-2刺突蛋白感染細胞，並在有中和抗體存在的情況下生長。他們的目標是選擇能夠使刺突蛋白逃避抗體識別的突變。

該實驗產生了對從COVID-19康復者血液中提取的抗體以及正在開發用於治療的強效單克隆抗體具有耐藥性的刺突蛋白突變體。Hatziioannou、Bieniasz和他們的團隊報告說，儘管突變的頻率很低，每一個刺突突變都是在從患者身上分離出來的病毒序列中發現的，表明正向選擇並沒有使突變更常見[11]。

其他科學家正試圖通過預測可能的重要突變，從而領先於SARS-CoV-2的演化過程。弗雷德·哈欽森癌症研究中心的演化病毒學家Jesse Bloom領導了一個團隊，創造了近4000個突變版本的刺突蛋白RBD，並測量了這種改變如何影響刺突蛋白的表達及其與ACE2結合的能力。大多數突變對這些特性沒有影響或阻礙，儘管少數突變改善了這些特性[12]。其中一些突變已經在COVID-19患者身上發現，但是Bloom的團隊沒有發現任何變異的自然選擇跡象。他說：“可能這種病毒與ACE2結合的程度和它現在需要的差不多。”

研究人員並沒有測試這些突變是否允許病毒阻止抗體的行動，但Bloom團隊的結果表明這些變化是可能的。“病毒將獲得突變並改變其對抗體和免疫的敏感性是一種可能性，但絕不是肯定的。”Bloom說。

根據研究其他冠狀病毒的經驗，這可能需要數年時間。針對普通感冒冠狀病毒的研究，在多個季節取樣，已經確定了其對免疫反應的一些演化跡象。但是，伯爾尼病毒學和免疫學研究所的RNA病毒學家Volker Thiel說，變化的步伐是緩慢的，“這些病毒株或多或少保持不變。”

由於世界上大多數人仍然對SARS-CoV-2易感，免疫不太可能是目前病毒演化的主要因素。但Sheahan說，隨着全人口免疫力的提高——無論是通過感染還是通過接種疫苗，免疫規避突變的不斷產生可能幫助SARS-CoV-2永久性地存在，當它感染那些因爲曾經感染或接種疫苗而有殘留免疫力的個體時，可能會引起主要爲輕微的症狀。

“如果這種病毒繼續以一種更常見的、致感冒的冠狀病毒形式存在，我不會感到驚訝。”但還有一種可能：我們對冠狀病毒感染（包括SARS-CoV-2）的免疫反應不夠強烈或不夠持久，不足以產生導致病毒毒株發生顯著改變的選擇壓力。

如果抗體療法使用不當，令人擔憂的突變也可能變得更加常見——例如，如果COVID-19患者接受一種抗體，而這種抗體可能因單一病毒突變而失效。研究人員說，單克隆抗體的雞尾酒療法（每一種抗體都能識別刺突蛋白的多個區域）可能會降低通過自然選擇獲得這種突變的幾率。疫苗在這一點上引起的關注較少，因爲就像人體的自然免疫反應一樣，它們往往會激發一系列抗體。

Montefiori團隊7月發佈在bioRxiv上的一項研究[13]發現，D614G的改變甚至有可能使病毒更容易成爲疫苗的靶標。小鼠、猴子和人類接種了一系列RNA疫苗中的一種，其中一種是輝瑞製藥公司正在研發的，它們產生的抗體被證明對G病毒的阻斷作用比對D病毒更強。

Montefiori說，由於G病毒現在無處不在，這一發現是“好消息”。但作爲一名科學家，他研究過艾滋病病毒通過突變逃避了許多針對它的疫苗，他仍然對SARS-CoV-2逃避人類免疫反應的可能性保持警惕。Luban 對此表示贊同：“我們需要密切關注其他變化。”

參考文獻：

1.Korber, B. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.04.29.069054 (2020).

2.Korber, B. et al. Cell 182, 812–827 (2020).

3.Grubaugh, N., Hanage, W. & Rasmussen, A. Cell 182, 794–795 (2020).

4.Muth, D. et al. Sci. Rep. 8, 15177 (2018).

5.Zhang, L. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.06.12.148726 (2020).

6.Plante, K. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.09.01.278689 (2020).

7.Volz, E. M. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.07.31.20166082 (2020).

8.Yurkovetskiy, L. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.07.04.187757 (2020).

9.Wrapp, D. et al. Science 367, 1260–1263 (2020).

10.Mansbach, R. A. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.07.26.219741 (2020).

11.Weisblum, Y. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.07.21.214759 (2020).

12.Starr, T. N. et al. Cell 182, 1295–1310 (2020).

13.Weissmann, D. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.07.22.20159905 (2020).

原文以 The coronavirus is mutating-does it matter? 爲標題發表在2020年9月8日的《自然》新聞特寫版塊

© nature doi:10.1038/d41586-020-02544-6

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