原標題：臨牀大隊列蛋白質組學整體解決方案助力精準診療

簡介

在精準醫學和大數據時代、人工智能的大背景下，高通量大隊列樣本組學（Omics）研究在生命科學研究以及在臨牀病理研究、臨牀診療領域得到廣泛應用。蛋白質作爲生命活動和功能的直接執行者，在研究生理、病理機制以及臨牀診斷、預後評估、治療靶點以及藥物靶點研究中扮演着重要角色。蛋白質組學大隊列樣本在臨牀診療、疾病機制研究中的應用受到科學家的廣泛關注。

然而，制約大隊列樣本蛋白質組學技術的兩大因素極大地限制了其應用，一是針對大樣本質譜檢測的機時問題以及由此帶來的批次效應（質譜長時間運行導致其性能下降，樣品間的儀器誤差增大），二是對複雜的大樣本數據的深度挖掘。金開瑞針對這兩個問題專門開發了包含蛋白質組學技術服務、大數據深度挖掘和標誌物深度驗證三大模塊的臨牀大隊列樣本蛋白質組學整體解決方案，爲科研工作者提供專業、全方位的技術服務。

方案流程

1. 蛋白質組學技術

2. 大數據深度挖掘

3. 疾病標誌物驗證

通過高通量、大規模蛋白質組學技術及生物信息學、統計學等手段，可以篩選到部分候選蛋白標誌物，其表達量往往在疾病/正常樣本中具有明顯的差異。但是，僅僅通過蛋白質組學手段不足以確定，還需要進行進一步驗證和確證[1]（下圖）。金開瑞擁有成熟的抗體制備平臺、Wester Blot實驗平臺、免疫組織化學平臺和ELISA製備平臺，爲您提供完整的標誌物各階段驗證實驗。

標誌物篩選的四個步驟

技術優勢

1. microflow-LC技術[2-5]

微流控液相色譜-質譜（microflow-LC MS/MS）系統由於其大流速、粗管路的特點，具有耐髒、高穩定性、短梯度等優勢，在處理大隊列樣本過程，可大大降低質譜數據採集過程的偏差，提升隊列數據的整體質量。具體表現爲如下優勢：

• 大幅縮短檢測週期。處理100例樣本，傳統LC-MS/MS系統大約需12天左右，採用micro-SWATH僅需5天即可完成。
• 有效降低批次效應。得益於微流控系統的高穩定性和短梯度等特點，microflow系統在處理大隊列樣本時表現出卓越的一致性，幾乎無批次偏倚。

定量結果表現出良好的一致性（20例人血漿樣本）

• 極大提升定量準確性。microflow針對大樣本定量檢測表現出極佳的準確性，樣品間的相關係數普遍在0.9以上。

microflow-SWATH結果表現出良好的相關性（20例血漿樣本）

2. 數據分析整體解決方案

在精準醫學和大數據時代、人工智能的大背景下，大隊列樣本的數據分析成爲科學家關注的重點，也是難點。通過調閱相關CNS文獻報道，結合蛋白質組學數據本身特點，我們開發了一套專門針對臨牀疾病（尤其是腫瘤）的大隊列數據分析方案，充分挖掘大數據中隱藏的信息，爲臨牀診斷、治療及疾病機制研究提供可靠的證據。

• 數據預處理保證數據質量。三大維度預處理，保證高可靠、高質量數據[6]。

三大維度數據質量控制，確保數據的高質量

• 分子分型助力精準診療。蛋白質層面的分子分型可以幫助臨牀醫生更準確地識別不同類型的腫瘤，確定精準的治療方案，更加適合指導腫瘤患者用藥、治療，預後評估，並通過功能分析以及生存分析發現在通路富集和總體生存率層面蛋白分子水平分型是否存在顯著差異，進一步證實根據蛋白質進行分類的科學性。是腫瘤分子分型的又一大熱點[7]。

共識聚類的憑據共識矩陣和輪廓距離確定最佳分類數

• 多組學整合分析揭示病理機制。儘管目前的研究結果顯示轉錄組和蛋白質組表達趨勢相關性較差，但mRNA和蛋白作爲基因表達的共同產物，在某種程度上必然存在因果關係或相關關係。我們通過分子分型結果，對兩組學數據進行進一步細化、關聯，從而得到常規關聯分析所不能獲得的信息，並結合差異表達分析，深入挖掘關鍵功能模塊，探索疾病病理機制。除此之外，我們也開發了CNV/SNP對蛋白質表達/功能影響的相關算法，旨在研究基因層面突變對蛋白功能的影響[8]。

蛋白質組和轉錄組表達水平相關性分析

CNV和蛋白質/mRNA表達水平相關性分析

• 預後標誌物篩選實現精準診斷。使用合理的描述性統計學和相關性分析等手段，經過嚴格的篩選標準，最終通過Cox迴歸模型分析影響患者生存預後的因素，結合變化倍數，可挖掘出針對腫瘤不同分子型的特異性表達蛋白，並通過KM生存曲線分析判斷是否爲預後不良病例的特異性蛋白標誌物[8]。

標誌物篩選的基本流程

• 候選藥物靶點提名實現精準用藥。基於蛋白質組學及蛋白質組學分型結果，結合是否爲已知臨牀藥物靶點，可以針對腫瘤或特定分子型篩選具有藥物靶點潛能的顯著差異蛋白，從而達到精準用藥[9]。

3. 標誌物驗證和確證

蛋白質標誌物的鑑定往往需要經過四個階段：a) 發現階段，通過大隊列樣本蛋白質組學的Discovery 策略，結合數據的深度挖掘，最終選定上百種候選標誌物蛋白進行進一步驗證；b) 差異表達驗證，經過此階段，一般最終篩選到幾十種蛋白符合預期；c) 概念階段驗證，進而實現臨牀疾病診斷、治療的醫學轉化。金開瑞可提供多種蛋白質定性、定量驗證手段。

• 基於質譜PRM驗證。通過高分辨質譜對靶蛋白-肽段的特異識別檢測，可實現蛋白的精確定量，具有通量高、定量準確的優勢，一次可同時驗證上百種蛋白標誌物；

PRM驗證的基本原理

• 基於Western blot驗證。製備候選靶點蛋白的單多克隆抗體，基於抗原抗體的特異性反應實現對樣本中目標蛋白的定性/半定量檢測。驗證過程中可選擇多例表型差異的樣品進行平行檢測，通過識別信號的強弱及灰度分析值進一步判斷靶點蛋白作爲候選靶標的準確性。

Western blot驗證的基本原理

• 基於IHC驗證。製備候選靶點蛋白的單多克隆抗體，基於抗原抗體的特異性反應實現對樣本中目標蛋白的定性/半定量檢測。區別於WB，IHC更側重靶點蛋白的亞細胞定位，對特異性進一步做了補充，着色深淺跟目標蛋白的含量呈正相關。

immunochemistry驗證的基本原理

• 基於Sandwich ELISA驗證。ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記，受檢標本加入後，與固相載體表面的抗原或抗體起反應，再加入酶反應的底物後，底物被酶催化成爲有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據呈色的深淺進行定性或定量分析。對於大分子的靶標蛋白檢測，通常是基於夾心ELISA原理進行定量檢測產品的開發，這一步主要是擴大測樣通量，以滿足診斷級別的樣本檢測例數，同時對靶標蛋白進行絕對定量。

Sandwich ELISA驗證的基本原理

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參考文獻

1. Del Campo, M., et al., Facilitating the Validation of Novel Protein Biomarkers for Dementia: An Optimal Workflow for the Development of Sandwich Immunoassays. Front Neurol, 2015. 6: p. 202.

2. Broccardo, C.J., et al., Multiplexed analysis of steroid hormones in human serum using novel microflow tile technology and LC-MS/MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2013. 934: p. 16-21.

3. Sun, R., et al., Accelerated Protein Biomarker Discovery from FFPE Tissue Samples Using Single-Shot, Short Gradient Microflow SWATH MS. J Proteome Res, 2020. 19(7): p. 2732-2741.

4. Needham, S.R., Microspray and microflow liquid chromatography: the way forward for LC-MS bioanalysis. Bioanalysis, 2017. 9(24): p. 1935-1937.

5. Distler, U., et al., Enhancing Sensitivity of Microflow-Based Bottom-Up Proteomics through Postcolumn Solvent Addition. Anal Chem, 2019. 91(12): p. 7510-7515.

6. Gillette, M.A., et al., Proteogenomic Characterization Reveals Therapeutic Vulnerabilities in Lung Adenocarcinoma. Cell, 2020. 182(1): p. 200-225 e35.

7. Xu, J.Y., et al., Integrative Proteomic Characterization of Human Lung Adenocarcinoma. Cell, 2020. 182(1): p. 245-261 e17.

8. Gao, Q., et al., Integrated Proteogenomic Characterization of HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cell, 2019. 179(5): p. 1240.

9. Ge, S., et al., Author Correction: A proteomic landscape of diffuse-type gastric cancer. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 1850.