王敦出生於士族，在早年的時候就職於黃門侍郎，王衍推薦他爲青州刺史，在當時東海王司馬越掌權時任爲了揚州刺史。司馬睿移鎮建業，召爲軍諮祭酒，後來又繼劉陶任揚州刺史和都督征討諸軍事。還與王導共同扶植司馬氏的江東政權，消滅不從命的江州刺史華軼與鎮壓以杜弢爲首的荊湘流民起義。

當時東晉的經濟和軍事重心在於荊州和揚州，王敦進位鎮東大將軍和開府儀同三司，公元322年正月，王敦以誅隗翦惡爲名在武昌起兵，江南大族沈充也起兵響應，王敦攻入建康，殺掉了戴淵、周顗和刁協，劉隗只好投奔石勒。朝廷進爵武昌郡公，還屯武昌。而這一年剛好遇到元帝病死，明帝上位，在脅迫下手詔徵王敦入朝輔政。

公元324年明帝下令討伐。王敦以兄王含爲元帥，使錢鳳等率領三萬軍隊進攻建康，明帝親自率領六軍反抗。立身亂局的王敦迎娶晉武帝司馬炎的女兒襄城公主爲妻，官拜駙馬都尉，成爲了晉武帝的女婿。在公元299年，皇后賈南風廢掉太子司馬遹，把司馬遹趕到許昌而且還不允許東宮官屬送行，而王敦則與太子洗馬江統等人違命去送行，得到當時人們的讚歎。

在公元301年，趙王司馬倫篡奪帝位，並派王敦到兗州慰勞擔任兗州刺史的叔父王彥。三個月後，齊王司馬冏興兵討伐司馬倫，諸王都得以響應，此時王彥收到齊王的檄命，邀請一同起兵，隨後王彥畏懼司馬倫兵力強盛而不敢應命。王敦此時勸王彥響應，最終齊王擊敗了司馬倫，王彥亦獲功勳。

司馬倫失敗後，晉惠帝復位。在公元307年，司徒王衍推薦他做青州刺史，拜廣武爲將軍。不久又徵命王敦爲中書監，王敦將襄城公主的侍婢都分發給了將士，又向人分發金銀財寶給部衆後纔回到洛陽。此時在滎陽遙控政權的太傅司馬越來朝，王敦認爲他此行一定時有誅殺處罰，後司馬越果然收捕中書令繆播等十餘人並給予處死。

王敦到揚州後與王導一起輔助司馬睿在江南地區建立聲望，由於司馬睿依靠王敦和王導才能建立力量，所以當時人有說道“王與馬，共天下。”後來被徵拜尚書時，王敦卻堅持留在揚州不上任。司馬睿於是任命王敦爲安東軍諮祭酒。永嘉之亂後，晉懷帝被俘虜，當時的江州刺史華軼不肯順從司馬睿的指揮，司馬睿於是派遣王敦、甘卓和揚烈一起進攻華軼，並將華軼擊敗殺死。