靶向蛋白质降解分离PARP1抑制剂的催化抑制和捕获活性机制
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PARP1（PolyADP-ribose polymerase 1）属于催化二磷酸腺核苷糖基化修饰（ADP-ribosylation）的PARP蛋白家族，其是一个丰度非常高且性质稳定的核蛋白（半衰期大于60小时）。在体内，PARP1能够感应遗传毒性剂（如MNNG）和氧化应激等导致的单链DNA断裂，并通过水解NAD+催化靶标蛋白及其自身发生多聚二磷酸腺核苷糖基化修饰，从而招募和激活下游DNA损伤修复因子【1】。随后的研究发现，在缺乏同源重组修复的BRCA突变的癌细胞中，DNA的损伤修复和基因组的稳定维持高度依赖于PARP1的活性，从而对PARP1抑制剂（PARPi）异常敏感，形成协同致死（Synthetic Lethality）效应【2】。此外，PARP1也参与了一些如缺血再灌注损伤和神经退行性病变等病理过程，并在这些病理刺激下被过度活化，从而最终激活PARP1依赖的程序性细胞死亡途径（Parthanatos）【3】。因而，PARP1抑制剂也可用于治疗这类PARP1过度活化引起的病理性疾病。目前，已有四种PARP1抑制剂（Olaparib，Rucaparib，Niraparib和Talazoparib）通过美国FDA的审批作为临床抗癌药物，并在BRCA突变的乳腺癌、卵巢癌，以及胰腺癌等治疗中取得了巨大成功。
一直以来，PARP1抑制剂的作用方式被认为只是单纯抑制了PARP1的催化活性。但是，对PARP1抑制剂抗肿瘤作用深入研究发现，PARP1抑制剂除了阻断PARP1介导的DNA损伤修复信号外，也能通过“PARP1捕获（PARP1 Trapping）”机制杀死肿瘤细胞【4】。正常情况下，PARP1激活后会催化自身发生二磷酸腺核苷糖基化修饰，这种自修饰导致其与DNA间形成空间位阻和电荷排斥，PARP1因而从DNA上解离。PARP1抑制剂处理封闭了PARP1的催化活性而无法发生PARP1的自修饰，使得PARP1困在损伤的DNA上，最终形成PARP1-PARPi-DNA复合物而导致PARP1捕获。后续研究发现，PARP1捕获会干扰DNA的复制，进而造成双链DNA断裂，具有很高的细胞毒性（图1）。
图1 PARP1抑制剂的作用机制【4】
因此，PARP1抑制剂引起的PARP1催化活性抑制和PARP1捕获在功能上完全不同但又存在内在的联系（PARP1捕获是伴随PARP1催化活性抑制所发生的），亟需建立一种药理学方法将PARP1抑制剂的催化抑制和PARP1捕获分离开来，从而为进一步研究PARP1的催化抑制和PARP1捕获所介导的信号通路，以及各自的功能提供可行的研究手段。此外，由于PARP1捕获的高细胞毒性，传统PARP1抑制剂用于治疗PARP1过度活化引起的非癌性疾病（例如缺血再灌注和神经退行性疾病）的策略也有待商榷，亟需开发出一种模拟PARP1缺失的新型化合物（抑制PARP1下游信号而不造成PARP1捕获）用于该类疾病的治疗。
2019年10月28日，德克萨斯大学西南医学中心余永豪课题组在Nature Chemical Biology杂志上发表了题为“Uncoupling of PARP1 Trapping and Inhibition Using Selective PARP1 Degradation”的研究论文【5】。该研究合成并评估了一系列基于PROTAC技术的PARP1降解剂（PARP1 degrader），最终找到了一个具有高度细胞活性和特异性诱导PARP1降解的小分子化合物iRucaparib-AP6，从而将PARP1抑制剂的催化抑制和PARP1捕获活性分离开来，为研究PARP1的催化抑制和PARP1捕获所介导的特异性下游信号和功能，以及治疗组织缺血性损伤和神经退行性病变等疾病提供了可行性的技术手段和靶向药物（图2）。
为了开发出可以模拟PARP1缺失的小分子化合物，课题组使用了一种靶向蛋白质降解的技术诱导PARP1的特异性降解（该技术应用一个靶向蛋白水解的嵌合分子（PROTACs）来实现靶蛋白的降解。这个嵌合分子一端可结合靶标蛋白，另一端则通过结合细胞内E3泛素连接酶复合体而催化靶蛋白发生泛素化及蛋白酶体途径降解【6】）。PARP1因为其高丰度和高稳定性而很难有效被降解。课题组基于已报道的PARP1抑制剂与PARP1结合的晶体结构，系统性地检测了不同PARP1抑制剂作为PARP1结合部和不同中间链对PARP1的降解效果，以及不同E3泛素连接酶结合剂的催化效率。最终，课题组在Rucaparib的末端通过六聚乙二醇链（PEG6 linker）连接上CRBN的结合分子Pomalidomide，合成了一个PARP1降解剂——iRucaparib-AP6。在原代大鼠心肌细胞中，该小分子在低至50 nM的浓度依然能够诱导PARP1发生蛋白酶体途径降解，并在24小时内使得PARP1的降解达到90%以上，其降解PARP1的DC50约为90 nM。随后，课题组通过基于串联质谱标签（TMT）标记的定量蛋白质组学分析证实：iRucaparib-AP6特异性地诱导PARP1的降解而不改变其他蛋白分子的表达。
图2 PARP1降解剂的作用机制
如前所述，PARP1抑制剂的作用机制一方面是阻断了PARP1下游信号，另一方面是诱导PARP1捕获。通过二磷酸腺核苷糖基化修饰蛋白质组学分析，课题组发现Rucaparib和iRucaparib-AP6调控着相同的PARP1下游信号。随后对DNA损伤情况下PARP1捕获的研究发现，PARP1抑制剂Rucaparib处理导致大量PARP1蛋白粘附在染色质上形成PARP1捕获，而iRucaparib-AP6处理诱导PARP1发生降解从而不发生PARP1捕获。与之相一致的是，Rucaparib处理造成DNA损伤的大量累积并抑制细胞的增殖。而iRucaparib-AP6处理则完全没有类似的现象。此外，DNA烷化剂甲磺酸甲酯（MMS）处理在HeLa细胞中会诱导细胞的死亡，联合使用PARP1抑制剂Rucaparib显著促进MMS引起的细胞死亡；但是，联合使用PARP1降解剂iRucaparib-AP6仅稍微提高了细胞死亡率，进一步证明了PARP1捕获在PARP1抑制剂抗肿瘤作用中发挥着十分重要的功能。
随后，课题组利用原代心肌细胞和体外分化的肌肉细胞模型评估了iRucaparib-AP6在缺血性损伤中的治疗价值。PAPR1在损伤刺激下可以被过度激活，过度活化的PARP1一方面催化二磷酸腺核苷糖基化修饰产生大量的PAR，导致死亡信号分子PAR的积累，从而激活PARP1依赖的程序性细胞死亡途径；另一方面也会消耗大量的NAD+而导致NAD+的耗竭，从而激活NAD+的补救合成途径（利用ATP合成NAD+），进而使得ATP水平的降低而引起细胞内能量危机，并最终导致细胞坏死。通过对肌肉细胞缺血再灌注损伤的细胞模型进行分析，作者发现iRucaparib-AP6和Rucaparib均能够保护肌肉细胞免受缺血性损伤所导致的能量危机和细胞死亡；但是Rucaparib处理会产生明显的PARP1捕获和DNA损伤的累积。此外，传统的PARP1抑制剂Rucaparib处理还会阻碍肌肉前体细胞的正常增殖，而iRucaparib-AP6处理则未发生上述这些副作用。
该项研究为深入理解PARP1抑制剂引起的细胞毒性，以及PARP1捕获的内在机制和功能提供了新的技术手段，对深入理解PARP1抑制剂抗肿瘤机制具有深刻的影响；同时，该研究也为治疗PARP1过度活化引起的病理损伤的治疗提供了潜在的新策略，为进一步优化PARP1信号阻断策略开辟了一条新的道路。
据悉，德克萨斯大学西南医学中心生物化学系余永豪教授和陈绰教授为该论文的共同通讯作者，王帅博士和韩磊博士为论文的共同第一作者。此外，德克萨斯大学西南医学中心心脏内科刘志平教授也参与了该项研究。
近年来，余永豪课题组一直致力于开发基于质谱的大规模定量蛋白质组学技术来研究蛋白翻译后修饰。并结合传统生化，细胞生物学以及动物模型，来研究这些修饰的调控的生物学机理。在PARP和二磷酸腺核苷糖基化领域，除了探索PARP抑制剂的捕获机制外，余永豪课题组一直聚焦PARP1催化机制的研究，特别是PARP介导的二磷酸腺核苷糖基化修饰的蛋白质组学鉴定以及PARP1下游靶标分子功能方面的研究。
2013年，该课题组创新性地开发了针对天冬氨酸和谷氨酸修饰位点的二磷酸腺核苷糖基化蛋白质组的鉴定方法。该方法利用羟胺（NH2OH）攻击天冬氨酸/谷氨酸与ADR-ribose形成的酯键，从而产生一个15.0109 Da的衍生物，最终共鉴定到340个目标蛋白上的1048个修饰位点。这项研究极大地拓展了我们对于PAPR1下游目标蛋白及其修饰位点的认识，同时也为深入研究这些目标蛋白的功能提供了参考【7】。利用此项技术，余永豪课题组与其他研究PARP功能以及DNA损伤修复的实验室开展了广泛的合作。例如，与MD Anderson陈俊杰课题组的两次合作，团队共同鉴定发现PTEN和LKB1是Tankyrase的两个新底物，并探讨了他们的二磷酸腺核苷糖基化修饰在肿瘤发生和增殖过程中的调控机制【8,9】。
2016年与Lee Kraus课题组合作，在体外完成PARP的催化反应，并运用上述质谱方法鉴定了PARP1，PARP2和PARP3各自的底物蛋白及其相应的修饰位点【10】。该项研究揭示了PARP1在转录延伸过程中重要的调控作用，同时也为研究每一个PARP蛋白如何响应细胞信号刺激提出了研究策略。2017年，余永豪课题组进一步拓展了此项技术的应用，研究分析了九种不同的乳腺癌细胞中，其在蛋白质组学水平PARP1激活程度和下游信号通路的差异，对深刻理解PARP1在细胞应激反应以及抗癌药物靶点的选择等方面具有深远的影响【11】（详见BioArt报道：UTSW余永豪组在ADP-ribosylation研究领域取得新突破）。此外，这些研究对将来开发基于二磷酸腺苷核糖基化来预测PARP抑制剂敏感性的生物标记物同样具有重要的意义。目前课题组一个非常重要的研究方向就是将这些信息进行转化并开发成相关疾病的生物标记物和治疗药物。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41589-019-0379-2
制版人： 小娴子
参考文献
1. Gupte,R., Z. Liu, and W.L. Kraus, PARPs andADP-ribosylation: recent advances linking molecular functions to biologicaloutcomes. Genes Dev, 2017. 31(2):p. 101-126.
2. Lord, C.J. and A. Ashworth, PARP inhibitors: Synthetic lethality in theclinic. Science, 2017. 355(6330):p. 1152-1158.
3. Berger, N.A., et al., Opportunities for the repurposing of PARP inhibitorsfor the therapy of non-oncological diseases. Br J Pharmacol, 2018. 175(2): p. 192-222.
4. Murai, J. and Y. Pommier, PARP Trapping Beyond HomologousRecombination and Platinum Sensitivity in Cancers. Annual Review of CancerBiology, 2019. 3(1): p. 131-150.
5. Wang, S., et al., Uncoupling of PARP1 trapping and inhibitionusing selective PARP1 degradation. Nat Chem Biol, 2019.
6. Burslem, G.M. and C.M. Crews, Small-Molecule Modulation of ProteinHomeostasis. Chem Rev, 2017. 117(17):p. 11269-11301.
7. Zhang, Y., et al., Site-specific characterization of the Asp-and Glu-ADP-ribosylated proteome. Nat Methods, 2013. 10(10): p. 981-4.
8. Li, N., et al., Poly-ADP ribosylation of PTEN by tankyrases promotes PTEN degradationand tumor growth. Genes Dev, 2015. 29(2):p. 157-70.
9. Li, N., et al., Tankyrase disrupts metabolic homeostasis and promotes tumorigenesis byinhibiting LKB1-AMPK signalling. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 4363.
10. Gibson, B.A., et al., Chemical genetic discovery of PARP targetsreveals a role for PARP-1 in transcription elongation. Science, 2016. 353(6294): p. 45-50.
11. Zhen, Y., Y. Zhang, and Y. Yu, A Cell-Line-Specific Atlas of PARP-MediatedProtein Asp/Glu-ADP-Ribosylation in Breast Cancer. Cell Rep, 2017. 21(8): p. 2326-2337.