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PARP1（PolyADP-ribose polymerase 1）屬於催化二磷酸腺核苷糖基化修飾（ADP-ribosylation）的PARP蛋白家族，其是一個丰度非常高且性質穩定的核蛋白（半衰期大於60小時）。在體內，PARP1能夠感應遺傳毒性劑（如MNNG）和氧化應激等導致的單鏈DNA斷裂，並通過水解NAD+催化靶標蛋白及其自身發生多聚二磷酸腺核苷糖基化修飾，從而招募和激活下游DNA損傷修復因子【1】。隨後的研究發現，在缺乏同源重組修復的BRCA突變的癌細胞中，DNA的損傷修復和基因組的穩定維持高度依賴於PARP1的活性，從而對PARP1抑制劑（PARPi）異常敏感，形成協同致死（Synthetic Lethality）效應【2】。此外，PARP1也參與了一些如缺血再灌注損傷和神經退行性病變等病理過程，並在這些病理刺激下被過度活化，從而最終激活PARP1依賴的程序性細胞死亡途徑（Parthanatos）【3】。因而，PARP1抑制劑也可用於治療這類PARP1過度活化引起的病理性疾病。目前，已有四種PARP1抑制劑（Olaparib，Rucaparib，Niraparib和Talazoparib）通過美國FDA的審批作爲臨牀抗癌藥物，並在BRCA突變的乳腺癌、卵巢癌，以及胰腺癌等治療中取得了巨大成功。

一直以來，PARP1抑制劑的作用方式被認爲只是單純抑制了PARP1的催化活性。但是，對PARP1抑制劑抗腫瘤作用深入研究發現，PARP1抑制劑除了阻斷PARP1介導的DNA損傷修復信號外，也能通過“PARP1捕獲（PARP1 Trapping）”機制殺死腫瘤細胞【4】。正常情況下，PARP1激活後會催化自身發生二磷酸腺核苷糖基化修飾，這種自修飾導致其與DNA間形成空間位阻和電荷排斥，PARP1因而從DNA上解離。PARP1抑制劑處理封閉了PARP1的催化活性而無法發生PARP1的自修飾，使得PARP1困在損傷的DNA上，最終形成PARP1-PARPi-DNA複合物而導致PARP1捕獲。後續研究發現，PARP1捕獲會干擾DNA的複製，進而造成雙鏈DNA斷裂，具有很高的細胞毒性（圖1）。

圖1 PARP1抑制劑的作用機制【4】

因此，PARP1抑制劑引起的PARP1催化活性抑制和PARP1捕獲在功能上完全不同但又存在內在的聯繫（PARP1捕獲是伴隨PARP1催化活性抑制所發生的），亟需建立一種藥理學方法將PARP1抑制劑的催化抑制和PARP1捕獲分離開來，從而爲進一步研究PARP1的催化抑制和PARP1捕獲所介導的信號通路，以及各自的功能提供可行的研究手段。此外，由於PARP1捕獲的高細胞毒性，傳統PARP1抑制劑用於治療PARP1過度活化引起的非癌性疾病（例如缺血再灌注和神經退行性疾病）的策略也有待商榷，亟需開發出一種模擬PARP1缺失的新型化合物（抑制PARP1下游信號而不造成PARP1捕獲）用於該類疾病的治療。

2019年10月28日，德克薩斯大學西南醫學中心餘永豪課題組在Nature Chemical Biology雜誌上發表了題爲“Uncoupling of PARP1 Trapping and Inhibition Using Selective PARP1 Degradation”的研究論文【5】。該研究合成並評估了一系列基於PROTAC技術的PARP1降解劑（PARP1 degrader），最終找到了一個具有高度細胞活性和特異性誘導PARP1降解的小分子化合物iRucaparib-AP6，從而將PARP1抑制劑的催化抑制和PARP1捕獲活性分離開來，爲研究PARP1的催化抑制和PARP1捕獲所介導的特異性下游信號和功能，以及治療組織缺血性損傷和神經退行性病變等疾病提供了可行性的技術手段和靶向藥物（圖2）。

爲了開發出可以模擬PARP1缺失的小分子化合物，課題組使用了一種靶向蛋白質降解的技術誘導PARP1的特異性降解（該技術應用一個靶向蛋白水解的嵌合分子（PROTACs）來實現靶蛋白的降解。這個嵌合分子一端可結合靶標蛋白，另一端則通過結合細胞內E3泛素連接酶複合體而催化靶蛋白髮生泛素化及蛋白酶體途徑降解【6】）。PARP1因爲其高丰度和高穩定性而很難有效被降解。課題組基於已報道的PARP1抑制劑與PARP1結合的晶體結構，系統性地檢測了不同PARP1抑制劑作爲PARP1結合部和不同中間鏈對PARP1的降解效果，以及不同E3泛素連接酶結合劑的催化效率。最終，課題組在Rucaparib的末端通過六聚乙二醇鏈（PEG6 linker）連接上CRBN的結合分子Pomalidomide，合成了一個PARP1降解劑——iRucaparib-AP6。在原代大鼠心肌細胞中，該小分子在低至50 nM的濃度依然能夠誘導PARP1發生蛋白酶體途徑降解，並在24小時內使得PARP1的降解達到90%以上，其降解PARP1的DC50約爲90 nM。隨後，課題組通過基於串聯質譜標籤（TMT）標記的定量蛋白質組學分析證實：iRucaparib-AP6特異性地誘導PARP1的降解而不改變其他蛋白分子的表達。

圖2 PARP1降解劑的作用機制

如前所述，PARP1抑制劑的作用機制一方面是阻斷了PARP1下游信號，另一方面是誘導PARP1捕獲。通過二磷酸腺核苷糖基化修飾蛋白質組學分析，課題組發現Rucaparib和iRucaparib-AP6調控着相同的PARP1下游信號。隨後對DNA損傷情況下PARP1捕獲的研究發現，PARP1抑制劑Rucaparib處理導致大量PARP1蛋白粘附在染色質上形成PARP1捕獲，而iRucaparib-AP6處理誘導PARP1發生降解從而不發生PARP1捕獲。與之相一致的是，Rucaparib處理造成DNA損傷的大量累積並抑制細胞的增殖。而iRucaparib-AP6處理則完全沒有類似的現象。此外，DNA烷化劑甲磺酸甲酯（MMS）處理在HeLa細胞中會誘導細胞的死亡，聯合使用PARP1抑制劑Rucaparib顯著促進MMS引起的細胞死亡；但是，聯合使用PARP1降解劑iRucaparib-AP6僅稍微提高了細胞死亡率，進一步證明了PARP1捕獲在PARP1抑制劑抗腫瘤作用中發揮着十分重要的功能。

隨後，課題組利用原代心肌細胞和體外分化的肌肉細胞模型評估了iRucaparib-AP6在缺血性損傷中的治療價值。PAPR1在損傷刺激下可以被過度激活，過度活化的PARP1一方面催化二磷酸腺核苷糖基化修飾產生大量的PAR，導致死亡信號分子PAR的積累，從而激活PARP1依賴的程序性細胞死亡途徑；另一方面也會消耗大量的NAD+而導致NAD+的耗竭，從而激活NAD+的補救合成途徑（利用ATP合成NAD+），進而使得ATP水平的降低而引起細胞內能量危機，並最終導致細胞壞死。通過對肌肉細胞缺血再灌注損傷的細胞模型進行分析，作者發現iRucaparib-AP6和Rucaparib均能夠保護肌肉細胞免受缺血性損傷所導致的能量危機和細胞死亡；但是Rucaparib處理會產生明顯的PARP1捕獲和DNA損傷的累積。此外，傳統的PARP1抑制劑Rucaparib處理還會阻礙肌肉前體細胞的正常增殖，而iRucaparib-AP6處理則未發生上述這些副作用。

該項研究爲深入理解PARP1抑制劑引起的細胞毒性，以及PARP1捕獲的內在機制和功能提供了新的技術手段，對深入理解PARP1抑制劑抗腫瘤機制具有深刻的影響；同時，該研究也爲治療PARP1過度活化引起的病理損傷的治療提供了潛在的新策略，爲進一步優化PARP1信號阻斷策略開闢了一條新的道路。

據悉，德克薩斯大學西南醫學中心生物化學系餘永豪教授和陳綽教授爲該論文的共同通訊作者，王帥博士和韓磊博士爲論文的共同第一作者。此外，德克薩斯大學西南醫學中心心臟內科劉志平教授也參與了該項研究。

近年來，餘永豪課題組一直致力於開發基於質譜的大規模定量蛋白質組學技術來研究蛋白翻譯後修飾。並結合傳統生化，細胞生物學以及動物模型，來研究這些修飾的調控的生物學機理。在PARP和二磷酸腺核苷糖基化領域，除了探索PARP抑制劑的捕獲機制外，餘永豪課題組一直聚焦PARP1催化機制的研究，特別是PARP介導的二磷酸腺核苷糖基化修飾的蛋白質組學鑑定以及PARP1下游靶標分子功能方面的研究。

2013年，該課題組創新性地開發了針對天冬氨酸和穀氨酸修飾位點的二磷酸腺核苷糖基化蛋白質組的鑑定方法。該方法利用羥胺（NH2OH）攻擊天冬氨酸/穀氨酸與ADR-ribose形成的酯鍵，從而產生一個15.0109 Da的衍生物，最終共鑑定到340個目標蛋白上的1048個修飾位點。這項研究極大地拓展了我們對於PAPR1下游目標蛋白及其修飾位點的認識，同時也爲深入研究這些目標蛋白的功能提供了參考【7】。利用此項技術，餘永豪課題組與其他研究PARP功能以及DNA損傷修復的實驗室開展了廣泛的合作。例如，與MD Anderson陳俊傑課題組的兩次合作，團隊共同鑑定發現PTEN和LKB1是Tankyrase的兩個新底物，並探討了他們的二磷酸腺核苷糖基化修飾在腫瘤發生和增殖過程中的調控機制【8,9】。

2016年與Lee Kraus課題組合作，在體外完成PARP的催化反應，並運用上述質譜方法鑑定了PARP1，PARP2和PARP3各自的底物蛋白及其相應的修飾位點【10】。該項研究揭示了PARP1在轉錄延伸過程中重要的調控作用，同時也爲研究每一個PARP蛋白如何響應細胞信號刺激提出了研究策略。2017年，餘永豪課題組進一步拓展了此項技術的應用，研究分析了九種不同的乳腺癌細胞中，其在蛋白質組學水平PARP1激活程度和下游信號通路的差異，對深刻理解PARP1在細胞應激反應以及抗癌藥物靶點的選擇等方面具有深遠的影響【11】（詳見BioArt報道：UTSW餘永豪組在ADP-ribosylation研究領域取得新突破）。此外，這些研究對將來開發基於二磷酸腺苷核糖基化來預測PARP抑制劑敏感性的生物標記物同樣具有重要的意義。目前課題組一個非常重要的研究方向就是將這些信息進行轉化並開發成相關疾病的生物標記物和治療藥物。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41589-019-0379-2

製版人： 小嫺子

參考文獻

1. Gupte,R., Z. Liu, and W.L. Kraus, PARPs andADP-ribosylation: recent advances linking molecular functions to biologicaloutcomes. Genes Dev, 2017. 31(2):p. 101-126.

2. Lord, C.J. and A. Ashworth, PARP inhibitors: Synthetic lethality in theclinic. Science, 2017. 355(6330):p. 1152-1158.

3. Berger, N.A., et al., Opportunities for the repurposing of PARP inhibitorsfor the therapy of non-oncological diseases. Br J Pharmacol, 2018. 175(2): p. 192-222.

4. Murai, J. and Y. Pommier, PARP Trapping Beyond HomologousRecombination and Platinum Sensitivity in Cancers. Annual Review of CancerBiology, 2019. 3(1): p. 131-150.

5. Wang, S., et al., Uncoupling of PARP1 trapping and inhibitionusing selective PARP1 degradation. Nat Chem Biol, 2019.

6. Burslem, G.M. and C.M. Crews, Small-Molecule Modulation of ProteinHomeostasis. Chem Rev, 2017. 117(17):p. 11269-11301.

7. Zhang, Y., et al., Site-specific characterization of the Asp-and Glu-ADP-ribosylated proteome. Nat Methods, 2013. 10(10): p. 981-4.

8. Li, N., et al., Poly-ADP ribosylation of PTEN by tankyrases promotes PTEN degradationand tumor growth. Genes Dev, 2015. 29(2):p. 157-70.

9. Li, N., et al., Tankyrase disrupts metabolic homeostasis and promotes tumorigenesis byinhibiting LKB1-AMPK signalling. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 4363.

10. Gibson, B.A., et al., Chemical genetic discovery of PARP targetsreveals a role for PARP-1 in transcription elongation. Science, 2016. 353(6294): p. 45-50.

11. Zhen, Y., Y. Zhang, and Y. Yu, A Cell-Line-Specific Atlas of PARP-MediatedProtein Asp/Glu-ADP-Ribosylation in Breast Cancer. Cell Rep, 2017. 21(8): p. 2326-2337.

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