撰文 | 胡小話

責編 | 兮

酪氨酸磷酸化 (tyrosine phosphorylation) 可以通過控制蛋白的酶活、細胞定位以及蛋白之間的相互作用來調控多層級的信號網絡，因此具有極其重要的生理和病理意義。已有研究表明，酪氨酸磷酸化水平的失調會導致多種疾病的發生，尤其是腫瘤【1】。比如說，在肺腺癌 (Lung adenocarcinoma) 中發現表皮生長因子受體 (EGFR) 的致癌突變 (oncogenic driver mutations) 非常常見【2】。遺憾的是，儘管這些酪氨酸激酶在腫瘤發生發展過程的重要性已經被熟知，但我們仍不清楚的是：致癌突變引起的酪氨酸磷酸化信號重塑是如何導致腫瘤的發生？

不久前，來自丹麥哥本哈根大學的Jesper V.Olsen教授科研團隊在Cell雜誌上發表了題爲Oncogenic Mutations Rewire Signaling Pathways by Switching Protein Recruitment to Phosphotyrosine Sites的研究，他們開發了一套基於質譜技術檢測互作蛋白組學的方法，在肺組織中成功鑑定出超過1000個由EGF介導的酪氨酸磷酸化位點，並揭示了EGFR致癌突變導致下游磷酸化信號重塑的具體分子機制。

首先，爲了鑑定體內酪氨酸磷酸化信號如何逐級傳導，作者給分別給實驗組和對照組大鼠靜脈注射EGF和生理鹽水各處理5min，然後將大鼠的肺組織取出進行後續的全蛋白質組學測定、TiO2富集的蘇氨酸/絲氨酸磷酸化蛋白組學鑑定以及酪氨酸磷酸化抗體富集的酪氨酸磷酸化蛋白組學鑑定。作者共鑑定到超過45000條肽段，其中包括超過13000條蘇氨酸/絲氨酸磷酸化肽段以及超過1000條酪氨酸磷酸化肽段。這與之前磷酸化蛋白組學鑑定的結果一致，即酪氨酸磷酸化蛋白佔總磷酸化蛋白10%左右【3】。此外，作者一共鑑定到88個酪氨酸磷酸化位點在EGF刺激之後磷酸化水平顯著上升，這說明這88個位點對於酪氨酸磷酸化信號傳導至關重要。

由於酪氨酸磷酸化位點的激活往往作爲支架蛋白的錨定位點從而爲下游蛋白複合體形成提供必要條件。因此，爲了探究在EGF刺激之後，酪氨酸磷酸化如何介導下游蛋白複合體的形成，作者用之前鑑定到的88個酪氨酸磷酸化位點爲中心取前後各6個氨基酸合成88條帶生物素標記的“誘餌”肽段，使得其能在組織裂解液中“俘獲”對應的激酶蛋白，並進行後續的蛋白組學分析。最終，作者獲取到了目前最全的EGF調控的酪氨酸磷酸化特異的蛋白互作數據庫,作者鑑定到11個關鍵蛋白複合體，共74個蛋白參與EFG信號網絡的傳導，並描繪出了這74個蛋白之間的互作網絡。此外，作者發現不同蛋白複合體對於酪氨酸磷酸化序列基序具有一定的選擇性，比如說，GRB2/GRAP複合體傾向於結合pYxN基序，而PTPN6/PTPN11複合體則更傾向於結合pYVxL基序。這些結果表明酪氨酸磷酸化位點附近的氨基酸序列對於結合特定的蛋白複合體非常重要。

因此，作者推測EGFR酪氨酸磷酸化位點附近的突變很有可能會影響下游蛋白複合體的招募。EGFR P1091L被報道在肺癌裏是一個高頻突變，並且P1091位點恰好位於結合CRK複合體的酪氨酸磷酸化位點附近，此外，作者通過數據分析和生物信息學驗證發現CRK複合體的確更傾向於結合pYxxP基序。基於這些線索，作者猜測肺癌患者的P1091L突變很有可能會阻礙CRK複合體與EGFR的結合,這一結論在WT和P1091L患者肺癌組織樣品中得到了驗證：作者發現P1091L突變使得CRK無法與EGFR互作，取而代之的是SH2B1/SHIP2複合體，這與之前的磷酸化基序分析結果一致。最後，作者在體外用A549細胞對P1091L突變的生物學功能進行了驗證，結果表明P1091L突變體的ERK和AKT信號持續激活，並且具有更強的侵襲能力。

除了P1091L位點，作者還考察了其他五個肺癌中常見的EGFR突變--EGFR P1019S, EGFR N1094Y,EGFR N1112S, EGFR N1140S 以及 EGFR P1170S。這些結果都表明：酪氨酸磷酸化位點附近的突變的確可以作爲分子開關調控下游複合體的招募。

綜上，Jesper V.Olsen教授藉助蛋白組學的分析手段描繪出當前最全面的組織特異性的EGFR酪氨酸磷酸化信號調控網絡，更重要的是，在此基礎上揭示了肺癌中EGFR突變致癌的分子機制，這對於今後的臨牀治療具有很強的指導意義。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.09.008

製版人：珂

參考文獻

1. Klaeger, S., Heinzlmeir, S., Wilhelm, M., Polzer, H., Vick, B., Koenig, P.A., Reinecke,M., Ruprecht, B., Petzoldt, S., Meng, C., et al. (2017). The target landscape of clinical kinase drugs. Science 358, eaan4368.

2.Janne, P.A., Engelman, J.A., and Johnson, B.E. (2005). Epidermal growth factor receptor mutations in non-small-cell lung cancer: implications for treatment and tumor biology. J. Clin. Oncol. 23, 3227–3234.

2. Kandoth, C., McLellan, M.D., Vandin, F., Ye, K., Niu, B., Lu, C., Xie, M., Zhang,Q., McMichael, J.F., Wyczalkowski, M.A., et al. (2013). Mutational landscapeand significance across 12 major cancer types. Nature 502, 333–339.