CAR-T 療法是當今最火熱的免疫治療之一，也是近年來免疫醫學的重大突破。自 2017 年美國 FDA 批准第一款 CAR-T 療法上市後，歐洲、加拿大、日本也緊隨其後批准了 CAR-T 產品上市銷售。然而，要實現 CAR-T 細胞更廣泛的治療應用，就必須在多個層面進行設計，進而提高療效、安全性和攻克實體瘤。最近，來自美國加州大學（University of California）的研究人員對 CAR 設計、影響 CAR-T 細胞活性及 CAR-T 細胞與腫瘤微環境之間的相互作用三個方面進行了綜述，以期幫助科研人員更好地提出 CAR-T 細胞治療改進策略。

CAR的多種設計方法

布爾邏輯和邏輯門常被用來檢測 CAR 與多種抗原組合的反應，以尋找到可提高 CAR-T 細胞的安全性和抗腫瘤效果的方法。

“和”邏輯 (And logic) 中需要聯合使用兩種不同的抗原來激活 CAR-T 細胞，這種特異性的增加能降低 CAR-T 細胞脫靶效應 (on-target, off-tumor) 所帶來的毒性風險，這種毒性會攻擊與腫瘤細胞相同抗原的健康組織。

而與 “和 - 非” 邏輯（AND-NOT logic）一起使用就可以防止對健康細胞的毒性損傷。這種策略利用了一種抑制 CAR (iCAR)，它針對健康組織上發現的抗原，並與腫瘤相關抗原（TAA）激活的 CAR 進行配對。“和”和 “和 - 非” 邏輯下的 CAR-T 細胞通過增加特異性提高了安全性。

“或”邏輯下 CAR 可以識別兩種不同的腫瘤相關抗原，並且與任一抗原的結合都會誘導 T 細胞的激活，可通過避免抗原逃逸或腫瘤細胞丟失靶向表位來提高抗腫瘤療效。

圖 | 組合抗原識別：“和”、“和 - 非”、“或”

圖 | ON/OFF 開關和適配器介導的激活

除了上面提到的布爾邏輯和邏輯門，採取外部誘導或自調節開關的形式也可以改進 CAR 的安全性和可控性。

在 CAR-T 細胞治療中已經觀察到的系統性毒性包括：細胞因子風暴（Cytokine release syndrome, CRS）、神經毒性和脫靶效應（On-target/off-tumor recognition）、CAR-T 細胞相關腦病綜合徵(CRES)、腫瘤溶解綜合徵和過敏反應等。當 CAR 產生的毒性成爲一個可預期的風險時，人們開始探尋調節 CAR-T 細胞活性的方法。

調節 CAR-T 細胞活性的方法之一，是通過調節 CAR 蛋白本身的穩定性或構象來調節CAR 的活性。比如，可以通過小分子藥物或製造缺氧條件來控制 CAR。控制 CAR 蛋白的變化不僅可以調節蛋白質的半衰期，還可以調節 CAR 功能的可用性，這樣受體只有在特定的條件下才具有信號能力。例如，CAR 的抗原結合區域可以被一個內置的抑制肽“掩蔽”，這樣 CAR 的功能結構只有在抑制肽被通常活躍在實體瘤微環境中的蛋白酶裂解後才能被激活。

科學家 Urbanska 曾發現一種 “通用” 受體，它包含生物素結合域，能融合到 T 細胞信號域上。原則上，表達這種生物素特異性受體的 T 細胞可以靶向任何已被生物素化抗體標記的靶細胞。

以此產生的對應策略有兩種：

(1)通過使用或保留生物素化抗體來控制 T 細胞的開 / 關狀態;

(2)通過改變生物素化抗體的特異性，使用相同的生物素特異性受體來靶向多種實體瘤微環境。

除了設計 CAR 本身，在細胞水平上改變 T 細胞活性也會顯著影響 CAR-T 的治療效果和安全性。

調控 CAR-T 細胞活性的多種設計方法

由 mRNA 電穿孔引起的短暫 CAR 表達，可以減輕 CAR 交叉識別健康組織引起的毒性。例如，針對治療白血病和骨髓瘤的 CD44v6 抗原靶向的 CAR-T 細胞已經被設計成單純表達皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK），這使得 CAR-T 細胞暴露於更昔洛韋藥物後，3 天內即可被有效清除。

另一種抑制毒性的方式是通過小分子、單抗藥物使 CAR-T 細胞衰竭。如使用誘導型 caspase 9（iCasp9）藥物，在 30 分鐘內即可消除 90% 以上的 CAR-T 細胞。此外，表面蛋白 CD20 或截短表皮生長因子受體（tEGFR）的轉基因表達也可以促進自殺機制。美國 FDA 已經批准的單抗藥物中，利妥昔單抗和西妥昔單抗可以分別與 CD20 和 tEGFR 結合，由此消除表達這些抗原的 CAR-T 細胞。

雖然自殺基因可以控制 CAR-T 細胞的毒性，但自殺基因的激活也會導致治療的不可逆終止。

另一種可逆策略是利用達沙替尼 (Dasatinib)，一種酪氨酸激酶抑制劑來干擾淋巴細胞特異性蛋白激酶（LCK）。達沙替尼已被證明是一種可逆的 CAR-T 細胞活性開關，停止給藥可以迅速逆轉其抑制作用，從而使其成爲 CAR-T 治療導致的致命毒性如 CRS 和 CRES 的潛在應急藥物。還可以使用轉錄調控，通過在翻譯後調控的方式，在保證 CAR 的穩定和功能的條件下提高 CAR-T 細胞的安全性。例如，小分子藥物多西環素（Dox）可以在 CAR 表達過程中起“開關” 作用。

除了控制基因的表達來控制 CAR-T 細胞活性外，另一種方法是使用基因編輯技術將特定基因整合到受內源性轉錄機制調控的特定基因位點中，進而控制 CAR-T 細胞活性。

已經有證據表明，轉基因插入特定位點將影響 CAR-T 細胞的功能。如使用 CRISPR/Cas9 將 CAR 轉基因插入到 TRAC 位點產生的 CAR-T 細胞比使用逆轉錄病毒將 CAR 隨機插入基因產生的 CAR-T 細胞在體內擁有更好的功能。基因編輯技術還可以消除內源性基因，用來保護 CAR-T 細胞免受移植物抗宿主病（GvHD）的傷害，以支持使用異體 T 細胞治療。基因編輯技術也可以用來消除 T 細胞活性負調節因子的表達。腫瘤細胞經常上調免疫檢查點受體的配體，如 T 細胞上的 CTLA-4 和 PD-1，導致腫瘤微環境中的 T 細胞活性受到抑制。

雖然 CAR-T 細胞對血液瘤有很好的治療效果，但對實體瘤的靶向性卻受到許多阻礙和挑戰。除抗原異質性外，腫瘤細胞在腫瘤微環境中會產生致瘤和免疫抑制因子，這種抑制環境與免疫抑制細胞作用疊加進一步影響 CAR-T 細胞的療效。

目前可通過改造 CAR 來對實體瘤進行殺傷，其原理是將 CAR 設計爲對腫瘤微環境中的細胞因子起作用。在腫瘤微環境中常見的免疫抑制性可溶性因子中，轉化生長因子 b（TGF-b）是一種作用效果明顯的細胞因子。可以將 CAR 設計爲對 TGF-b 起反應，使 CAR-T 在 TGF-b 存在的條件下增殖，保護附近細胞免受 TGF-b 的抑制作用。還可以使用“開關受體” 嵌合體來對 CAR-T 細胞進行調控。如由 IL-4 組成的“開關受體”在 CAR-T 細胞中的共表達可以增強它們的抗腫瘤能力。除了增強CAR-T 細胞的功能，“開關受體” 還可以減輕免疫檢查點的抑制作用。還有的改造策略是使 CAR-T 細胞靶向通過促進腫瘤生長和轉移的可溶性因子來控制腫瘤增長。

CAR-T 細胞如何對抗腫瘤微環境

腫瘤微環境的免疫逃逸和免疫抑制特性導致了 CAR-T 細胞對實體瘤治療效果不佳。

目前已知的腫瘤微環境特徵包括：（1）免疫細胞需要穿透腫瘤的物理屏障；（2）檢查點配體上調；（3）腫瘤前基質生態位；（4）豐富的免疫抑制和促轉移可溶性因子；（5）調節趨化因子的表達，以優先招募具有免疫抑制表型的白細胞。

這些已知特徵又推動了 CAR-T 細胞的設計。改造後的 CAR-T 細胞可以在腫瘤微環境中過度表達趨化因子受體，使腫瘤的防禦機制轉向針對自身；同時 CAR-T 細胞通過表達肝素酶（一種降解高密度結構細胞外基質的酶）可以改善在腫瘤浸潤和整體存活率。

圖 | CAR-T 細胞（黃色）正在攻擊乳腺癌細胞（粉色）（來源：德國羅伊特林根 “科學之眼” 攝影工作室）

成功到達實體瘤的 CAR-T 細胞接下來將面臨大量抑制性和逃避性特徵，爲了提高在這種免疫抑制環境中的治療效果，需要將 T 細胞改造爲可表達出以下效果蛋白質的 CAR-T 細胞：

（1）以自分泌方式改善 CAR-T 細胞功能

細胞因子是一種信號蛋白，具有顯著增強或消除 CAR-T 細胞功能的能力。與免疫刺激細胞因子共同表達的 CAR 可顯著提高免疫抑制性。例如，與單獨表達 CAR 的 T 細胞相比，構成共表達靶向 CD19 、 IL-2、IL-7、IL-15 或 IL-21 的CAR-T 細胞能夠實現更好的體內腫瘤控制率和增加在體內的持久性。

（2）破壞免疫抑制元件

免疫檢查點受體和配體如 PD-1/PD-L1 在腫瘤微環境中普遍表達，它們可以潛在地抑制 CAR-T 細胞的細胞毒性並誘導無反應性。因此，免疫檢查點阻斷與 CAR-T 細胞治療具有很強的協同潛力。CAR-T 細胞已被設計爲分泌免疫檢查點抑制劑，包括抗 PD-1 單鏈抗體和抗 PD-L1 抗體。

（3）誘導腫瘤微環境重塑

實體瘤微環境中還含有多種促進腫瘤發生和抑制 CAR-T 細胞功能的可溶性因子。例如，前列腺素 E2（PGE2）是一種生物活性脂質，通常在腫瘤中上調，它通過調節細胞增殖、遷移、凋亡和血管生成促進腫瘤存活。在 CAR-T 細胞治療的背景下，PGE2 和腺苷通過激活蛋白激酶 A（PKA）抑制 T 細胞信號傳導和活化，從而降低 T 細胞增殖和效應器功能。同樣通過改造後能表達過氧化氫酶基因的特異性 CAR-T 細胞，可以提高細胞內過氧化氫酶水平，減少細胞內過氧化氫含量，從而提升其對腫瘤細胞的溶解能力。

其他的提高 CAR-T 細胞治療效果的方法還有很多，如將 CAR-T 細胞設計成分泌細胞因子或其他可溶性因子，以旁分泌或內分泌方式誘導腫瘤微環境重塑。此外，CAR-T 細胞還可以通過分泌雙特異性 T 細胞接合器（BiTEs）來促進內源性 T 細胞與腫瘤細胞的結合。

結語

CAR-T 細胞治療在治療血液瘤方面顯示出巨大的前景。然而，對實體瘤的治療還面臨諸多挑戰，需要進一步改造 CAR-T 細胞來治療這些難治性惡性腫瘤。同時，在推進 CAR-T 細胞治療實體瘤的臨牀轉化過程中，還需要平衡 T 細胞內不同特性之間的生物複雜性和潛在干擾。

責任編輯：餘小飛

參考：

https://sci-hub.tw/https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.07.005?nsukey=MEUo9foRxs3%2BF1A7Pkp13Vd7nfwnMRNb80g64QczYJwNPOCI89dRB07JISHA5SQtcgZbNt6%2Bi3HdpTjJhk58GofKFEpoM7bs%2F5Rti3yOVu0z0eTtJo07Qdy%2F50BJPbPqebgrFx0LfgU2leq3%2FyLomP%2B7NwU0dEyZpX%2BbvpsQJ1SUmz5iTOMRrfac%2BDsFzcF9%2FXB1BOMPCj0GIDhux7D9Cw%3D%3D

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1535610820303664?via%3Dihub=

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