來源：Nature自然科研 

在地球上一些最極端的環境中——從有毒熱泉到高海拔沙漠，微生物都在努力活下去。這些“極端微生物”（extremophile）包括能生活在近沸騰的高溫或近冰凍的低溫、高壓或高鹽、酸性、鹼性、金屬或放射性環境下的生物。

誘導這些生物在實驗室中生長存在諸多挑戰。儘管如此，關於極端微生物的論文數量已經在過去十年裏翻了一倍。一些科學家被這些新奇的生物所吸引，想要尋找尚未被描述過或是攜帶了對工業生產或抗生素救命有用的酶的物種。另一些科學家只是單純地發現，能夠回答他們研究問題的最佳生物體恰好具有這些極端嗜好。

　　研究人員在土庫曼斯坦天然氣火山口的土壤樣本中尋找微生物，這裏也被稱爲“地獄之門”（Door to Hell）。來源：Stefan Green/XMP

這種情況下，研究極端微生物的研究人員需要發明新的實驗方法來處理它們。爲了能鑑別、培養、從遺傳學上操控並觀察極端微生物，研究人員常常需要調整他們在普通微生物身上使用的方法。有些技術很容易就改過來了，比如從一種嗜熱生物到另一種高溫生物，但有些技術則需要針對不同的生物體進行不同的調整。

“每個極端微生物都自有其挑戰，”約翰斯·霍普金斯大學的微生物學家Jocelyne DiRuggiero說道，“每次你想做些什麼，你就要思考，我要如何讓它來適應我研究的生物體？”

極端生長

2014年，美國佛蒙特大學的微生物學家Scott Tighe聯合國際合作者，發起了目前仍在進行的“極端微生物組項目”（XMP， http://extrememicrobiome.org/）。這些研究人員希望能找到可以顯示極端微生物如何生存的基因，以及它們是否能產生具有抗生素功效的化合物。

爲了尋找新的微生物，科學家深入極端地帶，包括埃塞俄比亞達納吉爾凹地（Danakil Depression）的有毒熱泉——含有大量的鹽、酸性物質、重金屬，以及土庫曼斯坦的天然氣火山口。

但是，他們最大的挑戰還是在實驗室裏，“可以說是巨大的障礙。”Tighe說。能在極端環境下不滅的都是微生物中的“小強”，這些“小強”是不會被科學家輕易分解再重新恢復它們的DNA的。爲此，Tighe和XMP團隊開發了一種含六種酶的“雞尾酒”——已取名“MetaPolyzyme”並上市——來分解它們能發現的所有細胞表面，通過加入清潔劑和有機溶劑，把核酸收集到磁珠上[1]。“我們必須用非比尋常的DNA提取技術纔行。”Tighe說。有了技術加持，研究人員便有了一冰箱可以分析的樣本，Tighe說。

　　英國一個研究團隊建造了這個加熱顯微鏡系統，用來拍攝嗜熱微生物硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius）的活細胞圖像。來源：A。 A。 Pulschen et al。/Curr。 Biol。 （CC BY 4.0）

在實驗室研究活的極端微生物也存在挑戰，比如DiRuggiero團隊研究的這種從智利高海拔阿塔卡馬沙漠的岩石上切下的嗜鹽微生物。她說，這些生物中有的很好培養：只要加鹽就行了。DiRuggiero還研究過需要在高溫無氧環境下生長的厭氧超嗜熱微生物。爲了培養它們，她將NASA研製的耐高溫培養瓶放在95 °C的恆溫箱中，這個培養箱太適合燒烤了，團隊開玩笑地稱它是“披薩烤箱”。塑料皮氏培養皿中的標準瓊脂會融化，因此，研究人員選擇在玻璃培養皿中放滿名爲“Gelrite”的結冷膠衍生物，它能抵抗高溫。

操縱基因 

改變極端微生物的基因還要做更多工作。對實驗室常用的大腸桿菌等微生物可行的工具和技術，包括用來轉移遺傳物質的質粒、將這些遺傳物質插入新微生物的技術，以及能選擇成功整合了新基因的微生物的化合物，往往不適合用於高鹽、超高溫和其他極端環境。

科學家經常用大腸桿菌生成他們想要的基因，分離相關質粒，再把它們轉到極端微生物中。一些極端微生物會吸收周圍介質裏的核酸，科羅拉多大學博爾德分校和美國國家可再生能源實驗室的合成生物學家Carrie Eckert說。如果這行不通，她推薦使用電穿孔，也就是用電脈衝在細胞膜上鑽孔。

另一個方法，她說，是通過測序確定極端微生物基因組的甲基化模式[2]。這很重要，因爲微生物常常會摧毀帶有“錯誤”模式的核酸，來防止入侵者。科學家正在學習如何改變大腸桿菌的甲基化系統，讓新的DNA與宿主的相匹配[3]。

一旦能提供正確甲基化的DNA，科學家就必須挑出吸收了這些DNA的極端微生物。爲了研究感興趣的基因，微生物學家常常會把這些基因插入含有抗生素耐藥性基因的質粒中；在含有這種抗生素的介質中生長的羣落已經吸收了這些基因。但許多抗生素無法在極端條件下發揮作用。另一種選擇工具是某個生物在沒有特定營養素下生長（或不生長）的能力——這種方法對極端環境不那麼敏感。

研究人員還爲極端微生物調整了基因編輯技術。Eckert的團隊開發了一種編輯嗜熱的熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）基因組的兩步法[4]。他們借用另一種嗜熱生物的基因交換系統，用來將他們想要的序列導入熱纖梭菌中。與此同時，他們 還改變了通常會被CRISPR–Cas系統識別並切割DNA的附近位點，讓它們對CRISPR不可見。之後，他們再利用CRISPR–Cas 切割任何沒有修飾的基因，清除未編輯的微生物。

這種方法的有效性最高可達94%，對其他極端微生物應該也同樣適用，Eckert說。需要的菌株可以從新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs） 和美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection）獲得，Eckert正在努力把質粒也加入Addgene的基因庫。

實時拍攝

爲了研究極端微生物的細胞生物學，研究人員對顯微鏡也來了個大改造。

英國醫學研究委員會分子生物學實驗室的細胞生物學家Buzz Baum對嗜熱嗜酸的硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius）的細胞分裂很感興趣。但Baum說，活的培養物在顯微鏡載物臺上，就和一杯茶涼得一樣快，這些細菌接着就進入了假死狀態。“我們做了好幾年都沒有成功。”

該團隊決定借用聚合酶鏈反應機器的一項技術，從頂部和底部同時給培養物加溫。他們聘請了實驗室一名成員的父親和兄弟，兩人都是航空工程師，他們用飛機用鋁打造了一個系統。研究人員已經發表了這個“Sulfoscope”顯微鏡的示意圖[5]，但Baum說任何雙重加熱系統都可以。這個系統讓團隊可以研究維持對稱細胞分裂的蛋白（見“嗜熱細胞分裂”）。

嗜鹽微生物也很難在顯微鏡下研究。它們缺少細菌那種堅硬的細胞壁，而且它們通過維持與周圍環境相同的滲透壓來生存，這讓它們的硬度就像泄了氣的氣球。也就是說，如果被夾在顯微鏡載片和蓋玻片之間，它們很容易就變形了，因此很難研究細胞的大小和形態。

Ye-Jin Eun在哈佛大學做博士後時便遇到了這個問題，當時她研究的是極端嗜鹽古菌（Halobacterium salinarum）是如何控制其大小的。這種生物在液體培養物中呈桿狀，但是，當她用軟瓊脂墊固定細胞做顯微鏡檢查時，它們就會變形成奇怪的多邊形或是一團無定形物質。“我們沒想到它那麼不經壓。”Eun說。Eun現在是新澤西州楊森製藥的首席數據科學家。馬薩諸塞州Millipore Sigma公司的CellASIC ONIX微流控設備能用軟聚二甲基硅氧烷固定微生物，但這種物質被證明對Eun的細胞有毒。

最後，她成功通過建造微型的瓊脂糖系統小心固定住了這些細胞，發現這個古菌維持大小的方式和細菌差不多，每個新生細胞在分裂前都會在杆體上添加一段固定不變的長度[6]。

熒光發光

顯微鏡學家還要找到能在極端條件下標記目標蛋白的方法。

一支國際團隊在研究死海中發現的沃式嗜鹽菌（Haloferax volcanii）時遇到了麻煩，因爲它所產生的一種色素會自然發出熒光。這讓研究人員很難用熒光蛋白標記來追蹤單個分子（團隊在7月發佈了預印本文章[7]）。爲此，團隊先刪除了參與合成該色素的基因，去掉微生物的顏色，但讓其他一切保持不變。

接着，研究人員處理了這種菌的遺傳學環境。和許多嗜鹽微生物一樣，沃式嗜鹽菌的DNA含有相對較多的鳥嘌呤和胞嘧啶，所以它的密碼子（編碼氨基酸的三聯體序列）也會使用這些鹼基。不僅如此，利用相同密碼子的基因的表達水平也會更高。因此，團隊優化了在非極端微生物中作用的熒光蛋白的密碼子，來配合這些極端微生物的偏好。

“大部分都管用。”文章的作者之一、悉尼科技大學分子微生物學家Iain Duggin說。深紅色蛋白mCherry和綠色變紅色的光轉換標記Dendra2的版本對於單分子追蹤格外有用。“這些在細胞分裂和形態還有細胞骨架研究中的應用真的讓我們非常激動。”Duggin說。

確實，通過不懈努力，研究極端微生物的科學家讓看起來不可能的實驗變成了可能。“關鍵是要去嘗試。”Duggin說，“‘極端微生物’，如果你喜歡這麼叫的話，通常沒有你一開始想的那麼難。”

參考文獻：

1.Tighe， S。 et al。 J。 Biomol。 Tech。 28， 31–39 （2017）。

2。 Flusberg， B。 A。 et al。 Nature Methods。 7， 461–465 （2010）。

3。 Riley， L。 A。 et al。 J。 Ind。 Microbiol。 Biotechnol。 46， 1435–1443 （2019）。

4。 Walker， J。 E。 et al。 Metab。 Eng。 Commun。 10， e00116 （2020）。

5。 Pulschen， A。 A。 et al。 Curr。 Biol。 30， 2852–2859 （2020）。

6。 Eun， Y。-J。 et al。 Nature Microbiol。 3， 148–154 （2018）。

7。 Turkowyd， B。 et al。 Preprint at bioRxiv https：//doi.org/10.1101/2020.07.27.222935 （2020）。

原文以Studying life at the extremes爲標題發表在 2020年10月27日的《自然》的科技特寫版塊上