近期，美國加州索科爾研究所（Salk Institute）的研究人員使用最新的納米孔DNA測序技術，在分子水平上對將新的基因插入植物基因組時的系列事件進行研究。索科爾研究所是美國生命科學領域成果最多、質量最高的研究機構之一。

研究人員繪製了具有最高分辨率的轉基因植物系的基因組和表觀基因組，以確切地揭示當插入一片外源DNA時，在分子水平上所發生一系列事件。他們的研究結果發表在了2019年1月18日的《PLOS遺傳學》雜誌上，研究闡明瞭用於植物編輯的常規方法，並提供了更有效地減少潛在脫靶效應的新方法。

不論是出於基礎研究目的，還是爲了增加糧食作物的健康或營養，當研究者想要將一種新的基因放入植物基因組中時，通常是依靠根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）來完成。土壤桿菌是引起冠癭腫瘤的細菌，常在樹幹上生成大的凸起。在幾十年前，科學家們發現當細菌感染樹木時，它會將一些DNA轉移到樹的基因組中。自那以後，研究人員便採用了土壤桿菌的這種轉移能力，根據自己的研究目的，利用它轉移DNA（T-DNA）的能力來將所需的基因轉移到植物中。

最近的DNA測序技術提示，當使用農桿菌T-DNA將新基因插入植物中時，它可能導致天然DNA的結構和化學性質發生額外變化。

文章的共同第一作者Florian Jupe研究員表示，“這其中最大的不確定因素在於T-DNA是否插入了基因組、並同時插入了你所想要的T-DNA拷貝數。”

由於T-DNA方法可以將所需基因的許多拷貝整合到植物中，因此難以使用傳統的標準DNA測序方法來對基因轉移的最終結果進行研究，這是由於大多數技術難以對高度重複的DNA序列進行測序。由此，研究小組轉向了一種新型的方法組合，通過結合納米孔長讀長測序（nanopore sequencing）和光學圖譜（optical mapping），在高分辨率的水平上對這些重複的長複雜片段進行觀察。

納米孔測序技術是由英國Oxford Nanopore Technologies公司研發的新一代單分子長讀長測序技術。其獨特優勢在於，它是一種基於電信號的測序技術，無需通過檢測光或者熒光信號來實現鹼基序列的讀取。可以實現對原始DNA或RNA模板進行直接、準確的測序。

在納米孔測序中，蛋白質納米孔被嵌入在合成膜上，在膜上形成通道，並浸沒在電生理溶液中，使離子電流通過納米孔。待測分子接近或通過納米孔時，會引起電流信號發生特徵性改變。原始電信號被用來進行實時分析，用來確定正在通過該孔的DNA或RNA鏈的鹼基序列。由於納米孔技術支持對分子進行直接測序，無需PRC擴增，從而能夠消除擴增帶來的偏好性。在納米孔測序中，讀長長度與製備樣本中DNA或RNA的長度一致。研究者可以根據實驗設計選擇恰當的樣品製備方案，自行決定讀長的長度。目前已能夠獲得數萬到數十萬鹼基的讀長，當前記錄最長讀長超過2Mb。

在具有大型結構變異和高水平重複區域的基因組中，長讀長能夠提供高質量、更完整、更連續的基因組組裝。並且能夠簡化組裝，如果把這比喻爲拼拼圖，讀長序列越長，組裝越容易。對於DNA來說，它的優勢在於能夠簡化從頭組裝，改進參考基因組，進行phasing，以及快速的宏基因組物種鑑定。對於RNA，它能夠用於表徵全長轉錄本，以及對異構體、剪接變體和融合轉錄本進行量化和分析。

研究人員將納米孔測序和光學圖譜結合，將其應用於植物生物學中常用的模型植物——擬南芥（Arabidopsis thaliana），並隨機選擇了四個T-DNA系。這些植物來自於大量T-DNA插入的突變體，這些突變體是通過一種名爲浸花法（floral tip）的擬南芥轉化方法而獲得，用於對基因功能進行研究。

利用光學圖譜分析T-DNA插入的大小和結構，結果顯示，這些植物在其基因組中具有一到七個不同的插入或重排，大小相差幾乎爲十倍。在MinION測序儀上對兩個品系進行納米孔測序（nanopore sequencing），並利用納米孔長讀長數據進行基因組重建後，研究人員獲得了高度連續的基因組組裝，在單鹼基水平的分辨率上證實了片段插入。其中包括在一個所選品系中，染色體之間發生交換或易位的整個DNA區段。基因插入本身顯示出了多種形態，插入的DNA片段有時會被打亂，會發生倒置甚至沉默。

“這項研究甚至在一年前都還不可能實現，” 文章的另一位聯合一作，來自J. CraigVenter研究所的Todd Michael表示，“Nanopore測序，有些人將它稱爲DNA測序的“聖盃”，它徹底改變了對基因組甚至是最複雜的區域的解讀，這些區域到此前爲止是完全無從接近和未知的。”

在研究小組研究名爲組蛋白的遺傳物質時，他們還發現了一些其他變化。組蛋白將DNA包裝到結構單元中，這些組蛋白的修飾介導一種基因是否可以被細胞使用，這種水平上的調節被稱爲表觀遺傳學。根據T-DNA整合的位置，某些附近組蛋白修飾的發生或消失可能會改變其他附近基因的調節或激活。

研究人員表示，在理想情況下，T-DNA會將所需基因單一的、功能性拷貝插入到植物中，並且對植物基因組無近期副作用。儘管他們的研究結果表明，在擬南芥中這種情況並不常見，但他們的方法爲更好地理解和監測這些影響提供了可能的途徑。

“現在，我們有了第一個對T-DNA插入如何塑造局部表觀基因組環境的高分辨率洞察。”

“這項技術非常令人興奮，因爲它可以讓我們獲得對這些轉基因擬南芥更清晰地認識。”

Salk研究所國際理事會遺傳學主席Joseph Ecker總結表示，“目前的方法需要篩選數百種轉基因品系，來尋找性能良好的、沒有額外插入的品系。這項技術可以提供更有效的方法。這是一個真正的起點，它意味着我們可以結合使用最新的圖譜和測序技術，來研究在植物基因組中插入一段基因可能發生的影響。擬南芥的基因組非常小，所以相對容易。但隨着DNA測序技術的持續提升，我們預見這種方法也可以被用於農作物植物。”

注: 以上全文根據Salk Institute官網發佈翻譯以改編。

如果您對在研究中使用納米孔測序技術感興趣，請掃描下方二維碼，與Oxford NanoporeTechnologies 取得聯繫。

參考來源：

https://www.salk.edu/news-release/new-technologies-enable-better-than-ever-details-on-genetically-modified-plants/

納米孔測序技術：https://nanoporetech.com/cn

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